雜質(zhì)吸附固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定糧食中15種真菌毒素

劉笑笑 ，丁 輝 ，吳福祥 ，苗 茜 ，姬良亮 ，彭 濤 ，張菁菁 ?

（1. 蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 741250；2. 甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測工程研究中心，甘肅 蘭州 741250）

真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，目前已知的真菌毒素有400多種[1]。糧食作物比較容易被真菌霉毒素污染，對人類健康影響較大的有黃曲霉毒素（AFT）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）等[2]，超過一定攝入量后會損壞人的肝功能、致癌、致畸并誘發(fā)免疫抑制性疾病[3]。世界衛(wèi)生組織已將真菌毒素納入食品安全體系重點監(jiān)測對象[4]，我國 GB2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》也對上述幾種真菌毒素在食品中的限量指標有嚴格的規(guī)定[5-8]。在自然情況下作物常常遭受多種真菌毒素污染，根據(jù)國家現(xiàn)行標準規(guī)定，需要同時采用幾種檢測方法進行多次實驗分析，才能測得不同真菌毒素的含量，測定方法不僅繁瑣，而且效率較低，因此，亟需建立多種真菌毒素同步檢測方法[9-12]。

Anastassiades等提出 QuEChERS（Quick， Easy，Cheap， Effective， Rugged， Safe）法，即分散固相萃取法，但是針對復雜基質(zhì)中多種毒素的提取仍有不足，雜質(zhì)吸附固相萃取法被廣泛應用于食品中有機殘留污染物的檢測，其中包括復雜的糧食及其制品[10-13]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術（LC-MSMS）具有更高的選擇性和靈敏度，逐漸成為同步檢測多種真菌毒素的主要手段[15]。

本研究將樣品經(jīng)過簡單提取和稀釋，利用雜質(zhì)吸附固相萃取凈化，優(yōu)化了液相色譜與質(zhì)譜條件，利用穩(wěn)定同位素內(nèi)標，建立了UPLC-MS-MS檢測糧食中多種真菌毒素的方法[12，14-16]。本方法簡單、快速、通量高、成本低，適用于大批量糧食樣品中多毒素的快速、準確定量檢測，可為糧食中真菌毒素的檢測和污染風險評估工作提供技術保障，減少因真菌毒素殘留帶來的食品安全問題。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC-MS/MS液相色譜-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源：美國安捷倫1290-G6460；Milli-Q超純水儀：德國默克密理博公司；氮吹儀：美國Organomation公司；Eppendorf5810R高速冷凍離心機：德國艾本德曼公司；BSA2202S- CW分析天平：梅特勒公司。

15種真菌霉毒素：黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素 B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-deoxynivalenol，3-AcDON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-deoxynivalenol，15-AcDON）、展青霉毒素（patulin，PAT）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（orchatoxin A，OTA）、T2毒素（T-2）、HT2毒素（HT-2），伏馬毒素 B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素B2（fumonisin B2，F(xiàn)B2）、伏馬毒素B3（fumonisin B3，F(xiàn)B3）：奧地利 Biopure和美國Sigma公司；[13C15]DON、[13C17]-3-AcDON、[13C17]AFB1、[13C17]AFB2、[13C17]AFG1、[13C17]AFG2、[13C34]FB1、[13C20]OTA、[13C34]FB2、[13C24]T-2、[13C22]HT-2、[13C18]ZEN12種全碳同位素內(nèi)標溶液：奧地利Biopure公司。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純：德國默克公司；乙酸銨（分析純）：國藥集團；乙酸（色譜純）：賽默飛；0.22 μm水系濾膜：天津津滕公司；實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

真菌毒素標準溶液配制：分別精密量取OTA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、FB1、FB2、FB3、T-2、HT-2、PAT、3-AcDON、15-AcDON毒素標準品1.000 mL，用乙腈各自定容至10 mL配制成標準儲備液，分別移取上述標準儲備液適量用乙腈稀釋成濃度分別為100 ng/mL，10 ng/mL，3.0 ng/mL，10 ng/mL，3.0 ng/mL，500 ng/mL，250 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，200 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL的混合標準中間液。加入一定濃度同位素內(nèi)標，配置成系列混合標準曲線。

1.2.2 樣品前處理

制備：抽取有代表性的樣品，用四分法縮減取200 g，粉碎后過0.4 mm孔徑的分析篩，混勻，裝入自封袋中，避光，備用。

提取：準確稱取粉碎均勻的樣品5 g（精確至0.001 g），于50 mL離心管中，加入25 mL1%乙酸酸化的 84%乙腈水溶液溶解，勻漿 1 min，加入3 g無水硫酸鎂、2 g氯化鈉脫水鹽提取，震蕩提取20 min，以提高提取率，震蕩后立即渦旋混合1 min，在4 ℃、4 900 r/min離心10 min，使得完全分離，取10.0 mL上清液待凈化。

凈化：加入裝有不同填料的凈化管中，HLB柱先活化，再移取10 mL上清液過柱，棄去凈化液，淋洗一邊，甲醇洗脫，收集洗脫液，加入12種同位素內(nèi)標混合液；PrimeHLB柱直接移取10 mL上清液過柱，收集凈化液，加入12種同位素內(nèi)標混合液；分別渦旋震蕩混勻，于 40 ℃水浴，氮吹至近干，1.00 mL甲醇復溶，經(jīng)0.22 um濾膜過濾，上機測定。對比不同組成及配比的凈化柱，以目標物的回收率為評價指標。

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.2.3.1 液相色譜條件 Kinetex 2.6 μm Bipheny l100A 色譜柱（LCColumn 50×2.1 mm，2.7 μm，phenomenon），流動相：A：0.1%（V/V）甲酸的2 mmol/L 甲酸銨溶液、B：甲醇，流速：0.3 mL/min，進樣體積：5 μL，柱溫：35 ℃。液相色譜梯度洗脫程序如表1所示。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子（electrosprayionization，ESI）源：正離子、負離子分別掃描；離子源溫度：正離子模式650 ℃，負離子模式600 ℃；氣簾氣：35 psi；碰撞氣：中等；電噴霧電壓：正離子模式：5 000，負離子模式：-4 500；Gas1：60，Gas2：65；其他質(zhì)譜條件參見表2。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradientelution program

表2 質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometry conditions

續(xù)表2

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進樣的方式，分別對 15種濃度為100 μg/L的目標化合物優(yōu)化其質(zhì)譜條件。本試驗分別在ESI+模式和ESI-模式下對15種真菌毒素進行全掃描，大多數(shù)化合物在ESI正極模式下都顯示了大量的[M+H]+離子，HT-2毒素和T-2毒屬于單端孢霉烯族毒素，其母離子都形成了[M+Na]+的形式，[M+Na]+的結合物靈敏度更高，因此上述2種毒素選擇[M+Na]+作為母離子。試驗表明，玉米赤霉烯酮和展青霉毒素在ESI-模式下響應更顯著，其余 13種毒素均在ESI+下有響應，確定母離子后，母離子進入二級質(zhì)譜得到各目標分析物碎片離子信息，確定定量離子對和定性離子對，優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)，考慮到正負離子模式頻繁轉(zhuǎn)換易造成儀器不穩(wěn)定，因此選擇分段采集模式試驗。15種真菌毒素優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表 2，MRM 色譜圖見圖1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動性的選擇

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)下電離，因此流動相的種類和比例不僅影響目標化合物的保留時間和峰形，還會影響到目標化合物的離子化效率，從而影響靈敏度，本文考察了對比流動相A：0.1%甲酸水溶液-甲醇，B：乙酸銨0.1%甲酸水溶液-甲醇，C：甲酸銨 0.1%甲酸水溶液-甲醇對15種真菌毒素質(zhì)譜響應的影響。結果表明，A為流動相，各毒素均有質(zhì)譜響應。當流動相中存在乙酸銨且濃度增至5 mmol/L時，雖然大部分對照品離子響應加強，但FB1和FB2無響應。用C作為流動相時，各真菌毒素的色譜峰信號強度明顯高于A和B，本文最終選擇2 mmol/L甲酸銨0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相。

2.2.2 色譜柱的選擇

圖1 15種真菌毒素的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the 15 mycotoxins

同分異構體有相同的母離子和子離子，在質(zhì)譜檢測上會產(chǎn)生干擾，因此必須在色譜上實現(xiàn)基線分離才能準確的定性、定量分析。本研究比較了不同類型的C18色譜柱對兩種毒素的分離效果，考察Aglient ZORBAX Elipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Phenomenon Kinetex Bipheny l100A 色譜柱(LCColumn 50×2.1 mm，2.7 μm)，3種色譜柱對15種真菌毒素的分離。Phenomenon Kinetex Bipheny l100A色譜柱對15種真菌毒素達到基線分離、峰形尖銳。同時也可以看出Phenomenon Kinetex Bipheny l100A色譜柱在20 min的洗脫梯度內(nèi)對多數(shù)毒素能夠?qū)崿F(xiàn)較好地分離（見圖 2中 C），因此最終選擇Phenomenon Kinetex Bipheny l100A 色譜柱(LCColumn 50×2.1 mm，2.7 μm)。

圖2 不同初始流動相對真菌毒素出峰的影響Fig.2 Effects of that gradient condition on the peak of the mycotoxins

試驗發(fā)現(xiàn)，流動相起始的比例對目標物的分離有較大的影響，圖2為三種梯度條件下15種真菌毒素的總離子流圖。由圖 2可知，A（起始比例為甲醇90%）和B（起始比例為甲醇50%）條件下，所有目標物出峰時間重疊，影響峰形，且無法分段采集，導致目標物響應降低。當水相起始比例為90%，按流動相梯度洗脫時（見表1），各化合物在15 min內(nèi)依次分離（見圖2中C），泵壓在20 min時達到平衡。

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1 提取條件優(yōu)化

2.3.1.1 提取溶劑的選擇 真菌毒素主要采用甲醇、乙腈或這兩種溶劑與水以不同比例混合后作為提取劑。由于不同基質(zhì)適應性不同，且15種真菌毒素理化性質(zhì)差異較大，選擇合適15種真菌毒素的提取溶劑至關重要，經(jīng)查閱文獻和標準，比較了 8種較為常見的提取溶劑：80%甲醇（MeOH）、50%乙腈（ACN）、70%ACN、84%ACN、80%MeOH 加入 1%乙酸（AA）、50%ACN 加入1%AA、70%ACN加入 1%AA、84%ACN加入1%AA對中藥材中15種真菌霉毒素的提取效率，結果表明，大部分真菌毒素乙腈的提取率要顯著優(yōu)于甲醇的，乙酸的加入對 ZEN、OTA、FB3、DON、HT-2的提取率有顯著提高，綜合考慮8種提取劑對 15種真菌霉毒素的提取效果，選擇84%ACN+1%AA作為提取劑。

2.3.1.2 助提取劑的選擇 本試驗中，選擇84%ACN加入1%AA作為提取劑，向提取液中加入助提劑，可以提高提取效率。選擇無機鹽NaCl+MgSO4作為本試驗的助提劑，可以促進分層，促使目標物進入有機相。分別考察當添加量為 NaCl（0、1、2、3、4、5 g）和 MgSO4（0、1、2、3、4、5 g）的添加量對提取效率的影響。結果表明：當NaCl為2 g時鹽析效果最好，大部分真菌毒素能達到較高回收率，NaCl添加量再增加時提取率無顯著變化，見圖 4；MgSO4添加量為3 g時除水效果較好，大部分真菌毒素能達到較高回收率，MgSO4添加量再增加時提取率無顯著變化，見圖5；因此，綜合考慮助提劑無機鹽NaCl+MgSO4的添加量對15種真菌霉毒素的提取效果，選擇2 gNaCl+3 gMgSO4作為本試驗的助提劑。

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化

圖3 不同提取溶劑對15種真菌毒素的回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of 15 mycotoxins

圖4 不同NaCl添加量對15種真菌毒素的回收率的影響Fig.4 Effect of different NaCl add on the recoveries of 15 mycotoxins

圖5 不同MgSO4添加量對15種真菌毒素的回收率的影響Fig.5 Effect of different MgSO4 add on the recoveries of 15 mycotoxins

本研究以糧食為基質(zhì)，利用 84%ACN加入1%AA作為提取劑，勻漿提取，并加入 2 gNaCl和3 gMgSO4助提劑，充分震蕩萃取后，3 900 r/min離心，移取上清液，考察2種不同的固相萃取凈化柱，考察添加標準下多種真菌毒素的回收率。HLB為反相固相萃取柱，對目標物進行吸附，將雜質(zhì)進行淋洗除去，而Prime-HLB主要是將雜質(zhì)吸附使目標物流出，不需要平衡活化可直接上樣，簡化和加速SPE流程。結果發(fā)現(xiàn)，2種凈化柱對15種真菌毒素回收率較好，其中Prime-HLB對這2類真菌毒素的加標回收率范圍為78.9%～101.1%，相對標準偏差在0.9%～5.1%，HLB柱凈化獲得的回收率在 58.5%～94.2%，相對標準偏差在 2.3%～12.0%。對比2種固相萃取柱，雜質(zhì)吸附型固相萃取柱除HT-2毒素外，回收率均優(yōu)于目標物吸附性固相萃取柱，主要是由于HLB柱并非對特定毒素具有專一吸附性，所以回收率的損失在凈化過程中的目標物吸附以及雜質(zhì)淋洗過程中都容易產(chǎn)生，具體結果見表 3。而玉米赤霉烯酮類毒素則需在酸性條件下凈化獲得的回收率較高，因此本試驗選擇Prime- HLB柱作為凈化柱。

2.4 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是在提取基質(zhì)中的目標物時，基質(zhì)中的干擾物影響目標化合物的離子化，主要源于樣品中的內(nèi)源性組分和樣品處理后引入的雜質(zhì)。在ESI離子化模式下，化合物的質(zhì)譜響應容易受到基質(zhì)的干擾，影響定量檢測的準確性。13C標記的穩(wěn)定同位素內(nèi)標與目標物有相同結構、化學性質(zhì)和色譜質(zhì)譜行為，因此也具有相同的基質(zhì)效應，在進樣之前加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標能夠補償進樣體積、ESI源的離子化效率、離子傳輸導致的目標物偏移，保證了質(zhì)譜分析結果的準確性和穩(wěn)定性。本研究將毒素的混合標準儲備液用空白樣品經(jīng)處理所得提取液和甲醇溶液分別稀釋，制得一定質(zhì)量濃度的2種標準工作液，用相對響應值法（基質(zhì)效應=空白基質(zhì)標準響應值/純?nèi)軇藴薯憫怠?00%，基質(zhì)效應大于 1時，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應；基質(zhì)效應小于1時，為基質(zhì)抑制效應）評價了15種真菌毒素在玉米、小麥和藜麥中的基質(zhì)效應見表 4。結果表面黃曲霉毒素、脫氧鐮刀雪腐菌烯醇毒素及伏馬毒素等在三種基質(zhì)中均有較強的基質(zhì)抑制效應，T-2毒素和HT-2毒素在三種基質(zhì)中均有基質(zhì)增強效應，影響結果的準確性。因此，在所有樣品和標液中加入穩(wěn)定同位素，以毒素峰面積與對應毒素內(nèi)標的峰面積比進行定量從而彌補真菌毒素的基質(zhì)效應影響，考慮到 15-AcDon市面上沒有穩(wěn)定同位素出售，選擇[13C17-3-AcDon作為內(nèi)標物質(zhì)。本實驗采用的分散固相萃取技術提取 15種真菌毒素的提取率很高，提取回收率基本在 80%～120%之間，同時穩(wěn)定同位素內(nèi)標價格昂貴，因此選擇在上機進樣前加入穩(wěn)定同位素。相比于樣品提取前加入同位素內(nèi)標，本方法大大減少了穩(wěn)定同位素的使用量，節(jié)約了檢測成本，又能夠有效地補償基質(zhì)效應的影響，保證檢測結果的準確。

表3 不同凈化柱對15種真菌毒素的回收率的影響Table 3 Effect of different Multifunction Clean-up Column on the recoveries of 15 mycotoxin %

表4 玉米、小麥和藜麥的基質(zhì)效應Table 4 Matrlx effects of 15 mycotoxins in maize, wheat and quinoa

2.5 方法學考察

2.5.1 方法的線性范圍及檢出限

將2.1中對照品配制標準曲線，向空白玉米、小麥及藜麥樣品中添加不同量的真菌毒素標準溶液，按照樣品處理方法進行前處理和檢測，采用空白基質(zhì)液逐級稀釋方法獲得各真菌毒素的檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），表 5列出 15種真菌毒素的線性范圍、檢出限、定量限。在各自的線性范圍內(nèi)，15種真菌毒素線性良好，相關系數(shù)R2均大于 0.996，檢出限和定量限均低于歐盟及我國規(guī)定的糧食中真菌毒素的限量標準，滿足限量檢出要求。

表5 15 種真菌毒素的線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限Table 5 Linear relationships, LODs and LOQs of 15 mycotoxins

2.5.2 不同基質(zhì)回收率及精密度

分別取藜麥、小麥、玉米的空白基質(zhì)，添加低、中、高三個水平的15種真菌毒素混合標準溶液，進行前處理，測定回收率，每個水平均測定6次，計算 RSD，結果見表 5，15種真菌毒素 3個添加水平的回收率為 76.9%～116.1%，RSD為1.4%～10%。

為了進一步驗證方法準確性，采用建立的檢測方法對玉米基質(zhì)標準物質(zhì)（FAPAS04319玉米）進行檢測驗證。驗證結果如表 7所示，8種真菌毒素的檢測值均在標示范圍內(nèi)，表明本文所建立方法準確可靠。

表6 玉米、小麥和藜麥中15種真菌毒素的加標回收率和精密度（n=6）Table 6 Recoveries and ralativest and arddeviations (RSDs) of 15 mycotoxins in Maize, Wheatand Quinoa sample (n=6)

表7 基質(zhì)標準物質(zhì)玉米中8種真菌毒素的檢測結果Table 7 Analytical results for the determination of 8 mycotoxins in maize reference materials ug/kg

2.6 實際樣品測定

隨機購買市售糧食 135批，在本文優(yōu)化條件下進行測定，共有97批樣品檢出真菌毒素，檢出率為71%，其中小麥中主要的污染毒素為DON、3-AcDON、15-ACDON、ZEN、FB1和FB2，玉米中主要污染毒素為DON、15-AcDON、ZEN、FB1，藜麥中主要污染毒素為 DON、OTA和 ZEN，多毒素同時污染現(xiàn)象較為普遍。最大濃度分別為小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為1 425 μg/kg、3乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為512.0 μg/kg、玉米中玉米赤霉烯酮為189.1 μg/kg、15乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為451.0 μg/kg，見表8，同時檢出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和黃曲霉 B1的玉米樣品和空白樣品的總離子流圖見圖 6，對于真菌毒素產(chǎn)生的原因及其對在糧食作物中的殘留對人體的危害需進一步通過實驗驗證。

表8 實際樣品中15種真菌毒素的檢測結果Table 8 Analyt ical results for the determination of 15 mycotoxins in real sample ug/kg

圖6 檢出多毒素的玉米樣品和空白樣品的總離子流圖Fig.6 Total ionflow diagrams of Maize samples and blank samples were obtained

3 結論

本研究通過優(yōu)化提取溶液體系，有效提高糧食基質(zhì)中15種真菌毒素殘留的回收率，通過固相萃取凈化，建立了回收率高、穩(wěn)定性強的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查和定量測定糧食中15種真菌毒素的方法。樣品采用電噴霧多反應監(jiān)測模式，以同位素內(nèi)標法進行定量分析，15種真菌毒素在各自濃度范圍內(nèi)線性良好，線性相關系數(shù)均大于 0.996，檢出限為 0.2～10，定量限為0.8～30，以藜麥、小麥、玉米三種基質(zhì)分別進行3水平加標回收實驗，回收率在76.9%～116.1%，相對標準偏差（RSD）為1.4%～10.4%，通過對基質(zhì)標準物質(zhì)進行驗證，檢測結果均落在證書范圍內(nèi)，本方法實現(xiàn)多種真菌毒素的同時分析檢測，穩(wěn)定性高、靈敏度高、專一性強、再現(xiàn)性好，可實現(xiàn)糧食中15種真菌毒素的快速篩查和準確定量，為真菌毒素的檢驗檢測提供了實用的技術手段。針對隨機購買市售糧食135批，共有97批樣品檢出真菌毒素，檢出率為71%，多毒素同時污染現(xiàn)象比較普遍，應當引起監(jiān)管的重視。