耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染的危險(xiǎn)因素及耐藥機(jī)制的研究

胡小飛 厲銀平 劉桂霞 彭清臻 王鋒

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院獲得性感染檢出排名僅次于大腸埃希菌的革蘭氏陰性桿菌，是造成呼吸道、泌尿道、血流等多個(gè)部位感染的重要致病菌之一。隨著人口老年化、侵入性操作增多以及抗菌藥物過度且不規(guī)范的使用，肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素的耐藥性日見增高，特別是耐碳青霉烯類菌株數(shù)量激增，對(duì)臨床治療造成極大困難。相比感染碳青霉烯類敏感的肺炎克雷伯菌(CSKP)患者，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)感染患者具有更高病死率及治療總費(fèi)用。因此，通過對(duì)相關(guān)臨床資料的分析，研究CRKP醫(yī)院感染的臨床特征、高危因素及耐藥機(jī)制具有重要意義。

資料與方法

一、資料

1 一般資料：收集我院2018年6月1日-2019年5月31日臨床分離的肺炎克雷伯菌，剔除同一患者同一次發(fā)病重復(fù)分離的菌株。菌株鑒定采用法國生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀。對(duì)診斷為肺炎克雷伯菌感染的病例進(jìn)行回顧性對(duì)照研究，收集入選患者的相關(guān)病史資料，包括 ：① 一般情況和基礎(chǔ)疾病特征；② 分離致病菌前抗生素使用情況；③ 感染特征；④ 相關(guān)侵入性操作；⑤相關(guān)治療方案。

2 儀器與試劑：藥敏紙片購自英國OXOID公司；MH瓊脂平板購自法國生物梅里埃公司；PCR引物由invitrogen公司合成；10X Buffer 、dNTPs(10 mmol/L)、Tap酶購自TOYOBO 生物科技有限公司；PCR儀為ABI 9600型；瓊脂糖購自碧云天生物技術(shù)有限公司；全自動(dòng)凝膠電泳成像系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品。

二、方法

1 藥敏試驗(yàn)：采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，抗菌藥物的敏感折點(diǎn)參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(clinical and laboratory standard institute，CLSI)2015年的標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)亞胺培南或美羅培南任一耐藥者判定為耐碳青霉烯類菌株。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

2 碳青霉烯酶基因的檢測：挑取1～2個(gè)菌落采用煮沸法制備細(xì)菌DNA模板。KPC及IMP型碳青霉烯酶基因采用PCR方法擴(kuò)增。基因引物序列分別為：KPC-R：GTCCAGACGGAACGTGGTAT、KPC-F：GCTCAGGCGCAACTGTAAGT(目標(biāo)片段334bp)和IMP-R：GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC、IMP-F: GCAGCCAAACCACTAWGTTATCT(目標(biāo)片段195bp)。反應(yīng)體系為：總體積50μL，其中10X Buffer 5μL、dNTPs(10 mmol/L)4μL、Tap酶0.25μL、上下游引物各(10μmol/L)l μL、模板DNA 2μL，高壓滅菌ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件參見相關(guān)文獻(xiàn)(10)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)紫外凝膠電泳成像儀下觀察結(jié)果，收集PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序分析(華大基因有限公司)，將所得測序結(jié)果通過GenBank中BLAST序列進(jìn)行比對(duì)以確定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類資料統(tǒng)計(jì)采用百分比表示。利用χ2檢驗(yàn)對(duì)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌感染的潛在危險(xiǎn)因素進(jìn)行單因素分析，然后進(jìn)行多元Logistic回歸分析篩選危險(xiǎn)因素，輸出OR值及其95%可信區(qū)間。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

共收集我院2018年6月1日-2019年5月31日臨床診斷為CRKP感染病例57例(CRKP組)，其中男性40例(70.1%)，女性17例(29.9%)，>60歲患者占43.8%；CSKP感染患者70例(CSKP組)，其中男性50例(71.4%)，女性20例(28.6%)，>60歲患者占58.5%(見表1)。

表1 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯組(CRKP組)和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯組(CSKP組)患者的一般情況[n(%)]

二、科室分布

CRKP組主要分布在呼吸科31.6%(18/57)、神經(jīng)內(nèi)科21.1%(12/57)、神經(jīng)外科14%(8/57)和ICU 10.5%(6/57)；CSKP組分布情況如下，呼吸科30%(21/70)、神經(jīng)內(nèi)科20%(14/70)、神經(jīng)外科17.5%(10/70)和ICU 11.4%(8/70)(見表2)。

表2 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯組(CRKP組)和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯組(CSKP組)患者的科室分布[n(%)]

三、感染部位分布

CRKP組主要為下呼吸道感染78.9%(45/57)、泌尿道感染17.8%(8/57)和血流感染6.7%(3/57)；CSKP組感染部位分布情況如下，呼吸道74.3%(52/70)、泌尿道17.1%(12/70)和血流5.7%(4/70)(見表3)。

表3 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯組(CRKP組)和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯組(CSKP組)患者的感染部位分布[n(%)]

四、抗生素使用情況

分離出肺炎克雷伯菌1個(gè)月內(nèi)，CRKP組中單藥治療者35.1%(20/57),其中三代頭孢/酶抑制劑13例，喹諾酮類1例，碳青霉烯類6例；兩種治療者38.6%(22/57),其中三代頭孢/酶抑制劑聯(lián)合喹諾酮類8例，單用三代頭孢/酶抑制劑升級(jí)為碳青霉烯類14例；三種治療者31.6%(12/57)，均為三代頭孢/酶抑制劑聯(lián)合喹諾酮類升級(jí)為碳青霉烯類12例。

在CSKP組中單藥治療者31.4%(22/70),其中三代頭孢/酶抑制劑15例，喹諾酮類7例，碳青霉烯類0例；兩種治療者5.7%(4/70),其中三代頭孢/酶抑制劑聯(lián)合喹諾酮類4例；三種治療者5.7%(4/70)，均為三代頭孢/酶抑制劑聯(lián)合喹諾酮類升級(jí)為碳青霉烯類4例。

五、CRKP感染危險(xiǎn)的單因素分析

對(duì)57人次CRKP感染者和70人次CSKP感染者進(jìn)行相關(guān)危險(xiǎn)因素的單因素分析，結(jié)果表明營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分≥3、1月內(nèi)使用三代頭孢/酶抑制劑、1月內(nèi)使用碳青霉烯類、留置尿管、PICC、氣管切開、機(jī)械通氣≥5天、抑酸劑≥5天及鼻飼是碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染的危險(xiǎn)因素(見表4)。

六、多元Logistic回歸分析

對(duì)上述9種高危因素使用Logistic逐步回歸分析方法進(jìn)一步篩選(α入=0.10，α出=0.15)。各因素賦值情況(見表5)。結(jié)果顯示1月內(nèi)使用三代頭孢/酶抑制劑、1月內(nèi)使用碳青霉烯類以及留置尿管為碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(見表6)。

表5 CRKP感染的高位因素與賦值情況

七、碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果

對(duì)57株CRKP菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有39株(68.4%)攜帶blaKPC基因,6株(10.5%)攜帶blaIMP基因。擴(kuò)增的KPC和IMP型基因產(chǎn)物(見電泳圖1～2)。

圖1 部分菌株擴(kuò)增blaKpC基因產(chǎn)物電泳圖(目標(biāo)片段334bp)

圖2 部分菌株擴(kuò)增blaIMP基因產(chǎn)物電泳圖(目標(biāo)片段195bp)

討 論

抗微生物藥物耐藥性已被列為世界衛(wèi)生組織2019年全球十大健康威脅之一。CHINET監(jiān)測網(wǎng)顯示肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%和2.9%上升到了2017年的20.9%和24.0%,與此同時(shí),肺炎克雷伯菌年分離率亦呈穩(wěn)步上升趨勢[1]。關(guān)于CRKP定值率的研究，土耳其專家回顧性分析了某醫(yī)院2009-2013年CRKP感染情況，結(jié)果表明CRKP定值率為6.8%[2]。本研究中，我院感染肺炎克雷伯菌患者中，CRKP感染者占9.6%(57/591)。從臨床科室分布看，CRKP感染者主要集中在呼吸內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科和ICU，占總數(shù)的77.2%(44/57),這與其收治患者基礎(chǔ)疾病、病情危重及多侵入性診治可能相關(guān)；從感染部位分布情況看，CRKP感染部位主要分布于下呼吸道和泌尿道，占總數(shù)的92.9%(53/57)，這與相關(guān)報(bào)道較一致[3]。

住院患者感染CRKP是導(dǎo)致死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[4]。因此，通過認(rèn)知CRKP感染的危險(xiǎn)因素進(jìn)而采取綜合預(yù)防措施減少其感染率顯得尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械通氣、各類留置導(dǎo)管等侵入性操作和濫用抗生素等為CRKP感染的高危因素，既往報(bào)道也佐證這一結(jié)論[5]。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)入院時(shí)營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)篩查評(píng)分(NRS-2002)≥3和應(yīng)用抑酸劑≥5天亦與CRKP感染密切相關(guān)，雖然在相關(guān)文獻(xiàn)分析中未得到類似結(jié)論[6]，但在其它耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌感染中得到報(bào)道[7]。進(jìn)一步的多元Logistic回歸分析表明，1月內(nèi)使用碳青霉烯類抗生素是CRKP感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與國內(nèi)外先前研究一致[8]。同時(shí)，1月內(nèi)使用三代頭孢/酶抑制劑和留置尿管也為CRKP感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究顯示，相比CSKP感染組，使用兩種或三種抗生素患者的比例在CRKP感染組中顯著增加。從本次回顧性病例對(duì)照研究的結(jié)果來看，應(yīng)從先前使用三代頭孢/酶抑制劑、碳青霉烯類和留置尿管等危險(xiǎn)因素入手減少CRKP感染的發(fā)生率。使用抗生素前應(yīng)綜合患者感染部位、病情輕重、耐藥性風(fēng)險(xiǎn)及本地感染的流行病資料等多方面因素，做到合理、有針對(duì)性使用[9]。在診療過程中，應(yīng)減少或縮短侵入性醫(yī)療器械的使用，加強(qiáng)手衛(wèi)生和醫(yī)院感染控制。

碳青霉烯類抗生素因?qū)Ξa(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和A mpC酶的革蘭氏陰性桿菌有很好的活性，在臨床重癥感染治療中往往取得令人滿意的療效。近年來，隨著碳青霉烯類過度及不規(guī)范使用，其耐藥菌株數(shù)量激增，特別是腸桿菌科肺炎克雷伯菌。碳青霉烯類抗生素耐藥的重要機(jī)制之一是產(chǎn)碳青霉烯酶，其中以KPC型、OXA型、IMP型和NDM型酶為主，因外膜通透性改變或(和)外排泵高表達(dá)所致藥物耐藥少見[10-12]。OXA型和NDM型酶更多見于耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌菌株。國內(nèi)相關(guān)研究表明，我國CRKP以產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶為主[13-14]。本研究也證實(shí)碳青霉烯酶的產(chǎn)生，我院CRKP耐藥的原因仍以產(chǎn)KPC型酶為主(39/57)，其次為產(chǎn)IMP型酶(6/57)。總之，細(xì)菌耐藥原因較為復(fù)雜，可能同時(shí)存在幾種耐藥機(jī)制。不同區(qū)域、不同狀態(tài)(感染或定值)、不同環(huán)境(一種或多種耐藥微生物感染)可能存在耐藥機(jī)制的多樣性。本研究只針對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的最主要機(jī)制產(chǎn)碳青霉烯酶做了相關(guān)探討，存在一定局限性。

通過認(rèn)知CRKP感染的高危因素及耐藥機(jī)制，給予綜合預(yù)防措施和針對(duì)性治療顯得十分重要。同時(shí)，應(yīng)著重防控其傳播。