HPLC法測定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷含量的研究

吳銀雙 李 莉 單 蕊 陳 燕 杜 冰 李海寧 姚 政*

1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；3.重慶市開州區(qū)中醫(yī)院，重慶 405400

野蠶豆根，又名化血丹、小紅藥、金貓頭(廣西)、靈芝草(云南) ，原植物來源于玄參科( Scrophulariaceae) 胡麻草屬( Centranthera) 植物大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth，主要分布于云南、貴州、廣西等地， 越南、緬甸、印度也有分布[1]。以根入藥，主要載于《中華本草》《全國中草藥匯編》《天然藥8404種詮釋》《云南中草藥》《中國民族藥志要》《紅河天然藥物》等書，具有消腫止痛、散瘀止血的功效,外用治外傷出血[2]。在云南省紅河州等地，野蠶豆根主要被用于防治多種心腦血管疾病，且療效顯著，系當?shù)孛缱宓貐^(qū)名貴地方藥。迄今為止，有關(guān)野蠶豆根的主要化學成分研究報道，主要含有環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、類胡蘿卜素類、紫羅蘭酮苷類、單萜苷類等豐富的生物活性物質(zhì)[3-5]。其中環(huán)烯醚萜苷類化合物是其主要化學成分，環(huán)烯醚萜苷具有抗炎、抗腫瘤、保肝、降糖、神經(jīng)系統(tǒng)保護作用等廣泛的藥理活性[6-7]，最新的研究還發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜苷類具有DNA合成酶抑制劑的作用，可開發(fā)成抑制DNA合成的抗腫瘤新藥[5]。桃葉珊瑚苷是野蠶豆根中含量最高的環(huán)烯醚萜苷類成分[3]。桃葉珊瑚苷在抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病、保肝、抗腫瘤、神經(jīng)保護及促進傷口愈合作用等功效顯著[8]，能明顯抑制乙型肝炎病毒DNA的復制和促進干細胞再生[9]。藥理研究顯示，野蠶豆根用藥安全，無明顯毒性反應(yīng)，有抗凝血及抗炎活性[10-11]，對心血管疾病和大鼠急性缺血模型所到處心肌損傷有保護作用[12-13]，泡制的酒可以防治腦血栓、腦梗[14]。該民族藥療效確切，有較好的應(yīng)用前景。目前，隨著野蠶豆根臨床需求量的增加，其野生資源已屬瀕危，當?shù)匾验_展人工種植。

有關(guān)HPLC法測定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷的含量，張傳利等[15-16]對其野生(根、莖、葉、花)、栽培的野蠶豆根不同部位(根、莖、葉、花、混合樣)的桃葉珊瑚苷、梓醇進行含量了測定，野生的野蠶豆根桃葉珊瑚苷的含量高低為：根>莖>花>葉，根的含量遠高于其他部位；栽培的野蠶豆根桃葉珊瑚苷的含量高低為：根>葉>混合樣>莖>花，根中的最高含量為0.930 mg/g；兩種野蠶豆根中梓醇在葉中含量都是最高的。色譜柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙晴-水(3∶97)，檢測波長205 nm。本研究對栽培野蠶豆根1年生根、莖葉；2年生根、莖葉中的桃葉珊瑚苷分別進行含量的測定，色譜柱：XBridge Shield C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-水(2∶98)，檢測波長203 nm。建立HPLC法測定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷含量的方法，為栽培野蠶豆根藥材質(zhì)量評價及采收的合理性提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e695型高效液相色譜儀、萬分之一電子天平(恒平,FA2004型)、十萬分之一電子天平(島津,SHIMADZU)、超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司,SK3300LH)、萬能高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司,DFY-C)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,RE-2000A)、電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司,DZKW-D-4)、循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司,SHZ-ⅢA)。

1.2 試劑 桃葉珊瑚苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號：111761-200601)。所用試劑均為分析純，使用娃哈哈純凈水，甲醇為色譜醇。野蠶豆根采自云南省紅河州屏邊縣國云種植有限公司栽培基地，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學李海寧老師鑒定為玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth.的根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取桃葉珊瑚苷對照品6.20 mg，置50/mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成0.124 mg/mL對照品溶液，避光冰箱保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備[17]分別精密稱取1年生根、莖葉、2年生根、2年生莖葉(1.0 g)，置于具塞錐形瓶中，加氯仿20 mL，超聲處理20 min，濾過。藥渣自然晾干后，加60%乙醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補足損失的質(zhì)量，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件及適用性實驗[18-19]色譜柱：XBridge Shield C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)；梯度洗脫程序：0～25 min 2%～98% B；25～30 min 80%～20% B；30～35 min 2%～98% B；流速1.0 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30℃，進樣量：20 μL。在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液2 μL，注入液相色譜儀。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1”對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于10 mL容量瓶中，依次稀釋定容，分別進樣20 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得線性回歸方程為：Y=6326522.085X-1747.411(R=0.9990)，線性范圍為：12.8～74.4 μg/mL。

2.5 精密度實驗 取“2.1”對照品溶液適量，按“2.3”色譜條件重復進樣6次，每次20 μL，記錄色譜圖，按峰面積計算相對偏差。桃葉珊瑚苷對照品的相對標準偏差(RSD)為1.44%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取“2.2”供試品溶液，按“2.3”色譜條件，精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，其相對標準偏差(RSD)為1.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復性實驗 精密稱取6份藥材，按“2.2”制備供試液，按“2.3”色譜條件分別進樣測定，每次20 μL，記錄色譜圖，按峰面積計算相對偏差。其相對標準偏差(RSD)為1.21%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取9份已知含量的野蠶豆根藥材粉末，每份0.50 g，按“2.2”制備供試液，分別精密加入一定量的對照品溶液，按“2.3”項色譜條件測峰面積，計算回收率，結(jié)果顯示桃葉珊瑚苷的平均回收率為100.98%，RSD=0.695%。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

2.9 供試品含量測定 分別取野蠶豆根(1年生根莖、莖葉；2年生根莖、莖葉)粗粉適量，平行稱取6份，按“2.2”制備供試液，按“2.3”色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用Excel 2010處理計算桃葉珊瑚苷的含量。

表2 各種樣品里桃葉珊瑚苷的所含的量 (n=6)

3 討論

野蠶豆根主要化學成分為環(huán)烯醚萜苷類化合物，其中含量最高的桃葉珊瑚苷,也是其中的活性成分之一，是評價野蠶豆根質(zhì)量標準的一個重要指標。本研究以桃葉珊瑚苷為測定指標，采用流動相甲醇-水溶液(2∶98)梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長203 nm的色譜條件，從而研究野蠶豆根中桃葉珊瑚苷的含量。實驗結(jié)果表明在此條件下峰形對稱性較高，無拖尾現(xiàn)象，測得含量穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，為野蠶豆根的開發(fā)與應(yīng)用提供實驗依據(jù)，同時也為其它藥材測定桃葉珊瑚苷化合物提供參考。

野蠶豆根在云南省紅河州一帶資源豐富，被當?shù)孛缱鍙V泛用于心血管系統(tǒng)疾病的防治，由于大量采集，現(xiàn)野生資源枯歇，目前在云南省紅河州已經(jīng)開展了大量人工種植，由于3年生野蠶豆根多發(fā)生根的腐敗而導致產(chǎn)量降低，故一般采收1～2年生藥材。本研究以桃葉珊瑚苷的含量為評價指標，對栽培野蠶豆根1年生、2年生根以及地上部份莖葉進行含量測定，桃葉珊瑚苷2年生根、1年生根、2年生莖葉、1年生莖葉的平均含量分別為：2.4815%、0.9759%、0.3758%、0.0266%。

2年生根、莖葉的桃葉珊瑚苷含量遠遠高于1年生根、莖葉的含量，為野蠶豆根藥材2年采收的合理性提供理論依據(jù)。

野蠶豆根主要化學成分是環(huán)烯醚萜苷類化合物，環(huán)烯醚萜苷類化合物在自然界中分布廣泛，是具有多種藥理活性的天然產(chǎn)物，有很高的藥用價值，其根中的桃葉珊瑚苷是含量最高的化合物。近代研究，野蠶豆根泡制的酒可以防治腦血栓、腦梗[14]，也明確了野蠶豆根作為防治心腦血管疾病候選新藥的開發(fā)價值，根作為原料還可以在新型藥物、抗腫瘤、保健食品、化妝品的添加劑等開發(fā)方面具有廣闊的前景。