HPLC法測(cè)定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷含量的研究

吳銀雙 李 莉 單 蕊 陳 燕 杜 冰 李海寧 姚 政*

1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；3.重慶市開(kāi)州區(qū)中醫(yī)院，重慶 405400

野蠶豆根，又名化血丹、小紅藥、金貓頭(廣西)、靈芝草(云南) ，原植物來(lái)源于玄參科( Scrophulariaceae) 胡麻草屬( Centranthera) 植物大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth，主要分布于云南、貴州、廣西等地， 越南、緬甸、印度也有分布[1]。以根入藥，主要載于《中華本草》《全國(guó)中草藥匯編》《天然藥8404種詮釋》《云南中草藥》《中國(guó)民族藥志要》《紅河天然藥物》等書，具有消腫止痛、散瘀止血的功效,外用治外傷出血[2]。在云南省紅河州等地，野蠶豆根主要被用于防治多種心腦血管疾病，且療效顯著，系當(dāng)?shù)孛缱宓貐^(qū)名貴地方藥。迄今為止，有關(guān)野蠶豆根的主要化學(xué)成分研究報(bào)道，主要含有環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、類胡蘿卜素類、紫羅蘭酮苷類、單萜苷類等豐富的生物活性物質(zhì)[3-5]。其中環(huán)烯醚萜苷類化合物是其主要化學(xué)成分，環(huán)烯醚萜苷具有抗炎、抗腫瘤、保肝、降糖、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用等廣泛的藥理活性[6-7]，最新的研究還發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜苷類具有DNA合成酶抑制劑的作用，可開(kāi)發(fā)成抑制DNA合成的抗腫瘤新藥[5]。桃葉珊瑚苷是野蠶豆根中含量最高的環(huán)烯醚萜苷類成分[3]。桃葉珊瑚苷在抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病、保肝、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)及促進(jìn)傷口愈合作用等功效顯著[8]，能明顯抑制乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制和促進(jìn)干細(xì)胞再生[9]。藥理研究顯示，野蠶豆根用藥安全，無(wú)明顯毒性反應(yīng)，有抗凝血及抗炎活性[10-11]，對(duì)心血管疾病和大鼠急性缺血模型所到處心肌損傷有保護(hù)作用[12-13]，泡制的酒可以防治腦血栓、腦梗[14]。該民族藥療效確切，有較好的應(yīng)用前景。目前，隨著野蠶豆根臨床需求量的增加，其野生資源已屬瀕危，當(dāng)?shù)匾验_(kāi)展人工種植。

有關(guān)HPLC法測(cè)定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷的含量，張傳利等[15-16]對(duì)其野生(根、莖、葉、花)、栽培的野蠶豆根不同部位(根、莖、葉、花、混合樣)的桃葉珊瑚苷、梓醇進(jìn)行含量了測(cè)定，野生的野蠶豆根桃葉珊瑚苷的含量高低為：根>莖>花>葉，根的含量遠(yuǎn)高于其他部位；栽培的野蠶豆根桃葉珊瑚苷的含量高低為：根>葉>混合樣>莖>花，根中的最高含量為0.930 mg/g；兩種野蠶豆根中梓醇在葉中含量都是最高的。色譜柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙晴-水(3∶97)，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。本研究對(duì)栽培野蠶豆根1年生根、莖葉；2年生根、莖葉中的桃葉珊瑚苷分別進(jìn)行含量的測(cè)定，色譜柱：XBridge Shield C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(2∶98)，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。建立HPLC法測(cè)定野蠶豆根中桃葉珊瑚苷含量的方法，為栽培野蠶豆根藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及采收的合理性提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e695型高效液相色譜儀、萬(wàn)分之一電子天平(恒平,FA2004型)、十萬(wàn)分之一電子天平(島津,SHIMADZU)、超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司,SK3300LH)、萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司,DFY-C)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,RE-2000A)、電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司,DZKW-D-4)、循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司,SHZ-ⅢA)。

1.2 試劑 桃葉珊瑚苷對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)：111761-200601)。所用試劑均為分析純，使用娃哈哈純凈水，甲醇為色譜醇。野蠶豆根采自云南省紅河州屏邊縣國(guó)云種植有限公司栽培基地，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李海寧老師鑒定為玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草CentrantheragrandifloraBenth.的根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桃葉珊瑚苷對(duì)照品6.20 mg，置50/mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成0.124 mg/mL對(duì)照品溶液，避光冰箱保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備[17]分別精密稱取1年生根、莖葉、2年生根、2年生莖葉(1.0 g)，置于具塞錐形瓶中，加氯仿20 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)。藥渣自然晾干后，加60%乙醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 色譜條件及適用性實(shí)驗(yàn)[18-19]色譜柱：XBridge Shield C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)；梯度洗脫程序：0～25 min 2%～98% B；25～30 min 80%～20% B；30～35 min 2%～98% B；流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液2 μL，注入液相色譜儀。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1”對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于10 mL容量瓶中，依次稀釋定容，分別進(jìn)樣20 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為：Y=6326522.085X-1747.411(R=0.9990)，線性范圍為：12.8～74.4 μg/mL。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1”對(duì)照品溶液適量，按“2.3”色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，記錄色譜圖，按峰面積計(jì)算相對(duì)偏差。桃葉珊瑚苷對(duì)照品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.44%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.2”供試品溶液，按“2.3”色譜條件，精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取6份藥材，按“2.2”制備供試液，按“2.3”色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，每次20 μL，記錄色譜圖，按峰面積計(jì)算相對(duì)偏差。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.21%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取9份已知含量的野蠶豆根藥材粉末，每份0.50 g，按“2.2”制備供試液，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果顯示桃葉珊瑚苷的平均回收率為100.98%，RSD=0.695%。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 供試品含量測(cè)定 分別取野蠶豆根(1年生根莖、莖葉；2年生根莖、莖葉)粗粉適量，平行稱取6份，按“2.2”制備供試液，按“2.3”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，采用Excel 2010處理計(jì)算桃葉珊瑚苷的含量。

表2 各種樣品里桃葉珊瑚苷的所含的量 (n=6)

3 討論

野蠶豆根主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜苷類化合物，其中含量最高的桃葉珊瑚苷,也是其中的活性成分之一，是評(píng)價(jià)野蠶豆根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究以桃葉珊瑚苷為測(cè)定指標(biāo)，采用流動(dòng)相甲醇-水溶液(2∶98)梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm的色譜條件，從而研究野蠶豆根中桃葉珊瑚苷的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在此條件下峰形對(duì)稱性較高，無(wú)拖尾現(xiàn)象，測(cè)得含量穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，為野蠶豆根的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為其它藥材測(cè)定桃葉珊瑚苷化合物提供參考。

野蠶豆根在云南省紅河州一帶資源豐富，被當(dāng)?shù)孛缱鍙V泛用于心血管系統(tǒng)疾病的防治，由于大量采集，現(xiàn)野生資源枯歇，目前在云南省紅河州已經(jīng)開(kāi)展了大量人工種植，由于3年生野蠶豆根多發(fā)生根的腐敗而導(dǎo)致產(chǎn)量降低，故一般采收1～2年生藥材。本研究以桃葉珊瑚苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)栽培野蠶豆根1年生、2年生根以及地上部份莖葉進(jìn)行含量測(cè)定，桃葉珊瑚苷2年生根、1年生根、2年生莖葉、1年生莖葉的平均含量分別為：2.4815%、0.9759%、0.3758%、0.0266%。

2年生根、莖葉的桃葉珊瑚苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1年生根、莖葉的含量，為野蠶豆根藥材2年采收的合理性提供理論依據(jù)。

野蠶豆根主要化學(xué)成分是環(huán)烯醚萜苷類化合物，環(huán)烯醚萜苷類化合物在自然界中分布廣泛，是具有多種藥理活性的天然產(chǎn)物，有很高的藥用價(jià)值，其根中的桃葉珊瑚苷是含量最高的化合物。近代研究，野蠶豆根泡制的酒可以防治腦血栓、腦梗[14]，也明確了野蠶豆根作為防治心腦血管疾病候選新藥的開(kāi)發(fā)價(jià)值，根作為原料還可以在新型藥物、抗腫瘤、保健食品、化妝品的添加劑等開(kāi)發(fā)方面具有廣闊的前景。