加味勻氣熏洗顆粒薄層色譜鑒別研究

李文靜 王繼永 潘 旭 劉 軍 賽紀(jì)虎

銀川市中醫(yī)醫(yī)院，寧夏 銀川 750001

加味勻氣熏洗顆粒處方為我院協(xié)定處方,由干姜、白芷、川芎、零陵香、紅花等十味藥組成，有芳香健脾益腎、化瘀通絡(luò)之功效，主用于脾腎兩虛夾瘀、寒凝血瘀引起的糖尿病性周圍神經(jīng)病變(DPN)、風(fēng)濕骨痛等[1-2]。全方體現(xiàn)用“香”特色，采用芳香藥物進(jìn)行淋浴、洗浴，藥液通過熏蒸的方法，使藥物有效成分穿過皮膚角質(zhì)和表皮擴(kuò)散、吸收，使脈絡(luò)組織代謝通暢，充分發(fā)揮寧夏地方特色及中醫(yī)藥優(yōu)勢，為DPN治療尋求一種安全方便、價(jià)廉效佳的外治手段。目前臨床上多結(jié)合熏蒸針刺等療法進(jìn)行治療且取得較好療效，但該臨方加工品種原劑型為粗粉，工藝較為落后，且缺乏質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。為了加快科技成果轉(zhuǎn)化和有效控制并改善其制劑質(zhì)量，本研究對(duì)原工藝進(jìn)行改進(jìn)將其制備為顆粒劑，并對(duì)處方中至少1/3藥味進(jìn)行TLC鑒別，旨在將其開發(fā)為醫(yī)院中藥制劑，擴(kuò)充其使用范圍。

1 儀器與試藥

XA105電子天平；ZF1紫外分析儀(上海耶茂有限公司)；硅膠G板、H板(青島海洋化工廠分廠+煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所)，對(duì)照藥材均從中國食品藥品檢定所購買，其中川芎對(duì)照藥材(120918-201411)；紅花對(duì)照藥材(120907-201412)；干姜對(duì)照藥材(120942-201309)；白芷對(duì)照藥材(120945-201309)；加味勻氣熏洗顆粒為我院制劑中心自制(20180705、20180706、20180708)；水是蒸餾水，其他試劑都是分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白芷TLC鑒別 取三批次本品各2 g，加20 mL石油醚(60～90 ℃)，超聲15 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為樣品溶液，另取對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液并依照加味勻氣顆粒處方制備工藝單劑量同法制成缺白芷的陰性對(duì)照液；參照藥典通則0502項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)，各吸取上述溶液10 μL，分別點(diǎn)于G板，用石油醚(60～90 ℃)-乙醚(3∶2)層析缸內(nèi)使展開[3]，取出，晾干，置254 nm的紫外燈下檢視[4]。樣品色譜與對(duì)照藥材色譜主斑點(diǎn)位置統(tǒng)一，分離較好且陰性無干擾。如圖1所示。

2.2 干姜TLC鑒別 取三批次本品各5 g，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至約20 mL，放冷，用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取2次，合并上層乙酸乙酯液，蒸干，加乙醇1 mL使殘?jiān)鼜?fù)溶，作為供試品溶液[5]。另取干姜對(duì)照藥材同法制成對(duì)照藥材溶液并照加味勻氣顆粒處方制備工藝單劑量同法制成缺干姜陰性溶液。照薄層色譜法(通則0502)實(shí)驗(yàn)，各吸取上述溶液5 μL，分點(diǎn)于同一硅膠G板，以石油醚(60～90℃)-氯仿-乙酸乙酯(2∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴適量2%香草醛硫酸溶液，105℃加熱，直到斑點(diǎn)清晰，在日光下檢視[6]。樣品色譜與對(duì)照藥材色譜主斑點(diǎn)位置統(tǒng)一，分離良好且陰性無干擾。如圖2所示。

2.3 川芎TLC鑒別 取三批次本品各1.4 g，加石油醚(60～90℃)20 mL，超聲15 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液，另取川芎對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液且依照加味勻氣顆粒處方制備工藝單劑量制同法得缺川芎的陰性對(duì)照溶液[7]。照薄層色譜法(通則0502)實(shí)驗(yàn)，各吸取上述溶液5 μL，分點(diǎn)于同一硅膠G板上，用甲苯-乙酸乙酯(3∶1)在層析缸內(nèi)展開[8]，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。樣品色譜與對(duì)照藥材色譜主斑點(diǎn)位置統(tǒng)一且清晰，分離較好且陰性無干擾。如圖3所示。

2.4 紅花TLC鑒別 取三批次本品各2 g，加80%丙酮20 mL，密塞，超聲30 min(40HZ)，靜置后過濾，取5 mL濃縮至1 mL，作為供試品溶液[9]；另取紅花對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液且按照加味勻氣顆粒處方制備工藝單劑量同法制缺紅花陰性溶液。參照藥典通則0502實(shí)驗(yàn)，各吸取上述溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H板，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(35∶10∶10∶2)為展開劑[10-11]，展開，取出，晾干。樣品色譜與對(duì)照藥材色譜中主斑點(diǎn)顏色及位置統(tǒng)一，分離較好。如圖4所示。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性考察 分別吸取白芷、紅花、川芎、干姜四味藥供試品溶液(批號(hào)：20180705、20180707、20180708)與對(duì)應(yīng)對(duì)照藥材溶液和陰性品溶液，按其擬定的相應(yīng)方法試驗(yàn)。結(jié)果均未見陰性對(duì)照有干擾(如圖1～4所示)。

2.5.2 耐用性考察

2.5.2.1 不同廠家薄層板的比較 取青島海洋化工廠分廠及煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所生產(chǎn)的薄層板(G、H)，分別按四味藥擬定的方法試驗(yàn)。結(jié)果無明顯差別。

2.5.2.2 不同溫度的比較 取點(diǎn)樣后的薄層板，分別在6℃和30℃中展開，結(jié)果表明在6～30℃范圍內(nèi)試驗(yàn)，對(duì)四味藥的鑒別均無明顯的影響。

2.5.2.3 不同相對(duì)濕度的比較 取點(diǎn)樣后的薄層板，分別在不同濕度的層析缸中展開，按擬定的方法試驗(yàn)。其中38%、80%硫酸水溶液分別放置層析缸一側(cè)(約5～6 mL以不溢至另一側(cè)為準(zhǔn))飽和30 min后，另一側(cè)倒入展開劑，放入點(diǎn)好的薄層板。結(jié)果表明在相對(duì)濕度38%～80%之間試驗(yàn)，對(duì)四味藥鑒別均無明顯的影響。

3 討論

3.1 工藝改進(jìn)方面 加味勻氣熏蒸顆粒處方是在我院黨毓起主任團(tuán)隊(duì)結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)組成的協(xié)定方(加味勻氣散)基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝改進(jìn)而來，組成有肉桂、干姜、炒桃仁、紅花、零陵香、地椒、白芷、川芎等，重用活血通絡(luò)、化瘀止痛藥物，有效改善局部組織細(xì)胞的通透性，以增強(qiáng)微循環(huán)血流，促進(jìn)藥物吸收，從而達(dá)到改善DPN引起的涼、麻、瘙癢、疼痛等不適，更重要的是可保護(hù)局部神經(jīng)損傷，具有止痛，尚能促進(jìn)病變組織修復(fù)。采用濕法制粒將原散劑改進(jìn)為顆粒劑并使用熱封型茶葉濾紙袋包裝，方便臨床熏蒸治療，且生產(chǎn)工藝簡單，藥味簡價(jià)廉，安全無創(chuàng)，易于DPN患者所接受，使內(nèi)病外治，由表及里，舒筋通絡(luò)，使發(fā)汗不傷營衛(wèi)，生產(chǎn)條件要求相對(duì)低，符合醫(yī)院制劑開發(fā)現(xiàn)狀。

3.2 鑒別藥味的選擇方面 本研究也曾對(duì)方中君藥肉桂、臣藥桃仁等進(jìn)行薄層鑒別方法建立，但因陰性干擾嚴(yán)重未作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。白芷、川芎、紅花、干姜的TLC鑒別實(shí)驗(yàn)均先參照藥典方法進(jìn)行考察，除干姜外，展開劑或提取溶液等根據(jù)情況有所變動(dòng)及調(diào)整。

3.3 川芎及白芷TLC建立 ①樣品前處理方面：藥典中白芷及川芎飲片在薄層鑒別制備樣品液時(shí)均先用乙醚浸泡振搖提取，濾液揮干后乙酸乙酯復(fù)溶；由于白芷和川芎的乙醚提取液在紫外燈下斑點(diǎn)均不明顯，為提高提取效率，最終選擇極性相似的石油醚超聲提取制備供試品溶液，結(jié)果斑點(diǎn)清晰度增強(qiáng)，得到明顯改善。②展開劑方面：川芎在以正己烷-乙酸乙酯(3:1)為展開劑[12]時(shí)，陰性干擾嚴(yán)重；以石油醚(60℃)-乙酸乙酯(4∶1)，主斑點(diǎn)RF值偏低，陰性有干擾；結(jié)合文獻(xiàn)屢次試驗(yàn)后川芎以甲苯-乙酸乙酯(3∶1)為展開劑。③薄層板選擇：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該制劑中川芎參照藥典使用GF254點(diǎn)板后，斑點(diǎn)不清晰。后使用硅膠G板在254 nm下紅花色譜造成的紅色背景消失，主斑點(diǎn)清晰，故最終選用硅膠G板。

3.4 紅花TLC建立 以藥典展開劑乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)展開后，RF值過大，不在0.2～0.8之間，故將水的比例降低，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(35∶10∶10∶2)為展開劑展開后RF值=0.68，3批樣品液圖譜與紅花對(duì)照藥材圖譜上紅色主斑點(diǎn)位置一致，斑點(diǎn)清晰且陰性無干擾。

目前該協(xié)定處方已完成穩(wěn)定性考察，擬近期備案為醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑從而服務(wù)更多DPN患者，擴(kuò)展其使用范圍。