UFLC-MS/MS法測定句容蟬花中核苷類成分肌苷、尿苷的含量

楊燕飛 顧 媛 劉 源 竇金鳳

江蘇省鎮江市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 鎮江 212000

蟬花別名冠蟬(《綱目》引《禮》注)、蟲花《四川中藥志》、蝘花《新華本草綱要》，為麥角菌科棒束孢屬真菌蟬棒束孢菌的孢梗束、蟲草屬真菌大蟬草的子座及其寄生的蟲體[1]。其味甘、性寒、疏散風熱、熄風止痙、明目退翳[2]。研究發現，蟬花含有含肝糖、蟲草酸、多種必需氨基酸、D-甘露醇、多種生物堿、麥角甾醇等有效成分。具有調節神經系統、增強免疫、抗炎、抗菌等保健和藥用活性[3]。

核苷類成分對人體免疫、代謝、心血管等有重要生理作用，具有抗菌等活性[4-8]，有研究表明尿苷有預防細胞損害和肝臟機能失調的作用，肌苷有助于受損肝細胞功能的恢復，促進肝細胞的活化，提高肝臟功能。核苷的測定方法有薄層色譜法[9]、毛細管電泳法[10]、高效液相色譜法[11]，其中以HPLC法較為普遍。目前，蟬花的質量標準在浙江、四川等省有收載，內容僅包括性狀、鑒別和檢查項。由于鎮江市句容地區環境適合蟬花的生長，而江蘇省目前未收載蟬花標準，故本文采用超高效液相色譜-質譜聯用(Ultra fast liquid chromatography-mass- mass spectrometry，UFLC-MS-MS)方法對句容蟬花中核苷類成分肌苷、尿苷進行含量測定，為蟬花的質量評價提供方法和依據，對句容蟬花進一步開發利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-MS-MS-8050(日本島津，含LC-30AD二元高壓泵， DGU-20A在線脫氣機，CTO-30A柱溫箱，SPD-M30A二極管陣列檢測器，三重四級桿質譜儀；CPA225D電子天平(賽多利斯公司，精度為0.01mg)。

1.2 試藥 肌苷對照品(中國食品藥品監督檢驗研究院 批號140669-201606，98.6%)，尿苷對照品(中國食品藥品監督檢驗研究院 批號110887-201803，99.5%)，甲醇為質譜純，水為Milli-Q超純水。6批蟬花均采收于句容茅山，由江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為Cordycepscicadae。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 對照品溶液的制備 分別精取肌苷13.79 mg、尿苷10.53 mg，加水溶解稀釋至100mL容量瓶中，作為對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品約0.10 g(過四號篩)，置50 mL量瓶中，加水40 mL超聲30 min，定容至刻度，搖勻，濾過，精取續濾液1 mL，稀釋至50 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 Shim-pack XP-ODSⅢ(2.0 mmI.D×75 mm，1.6 μm)為色譜柱；流動相：水-甲醇(95∶5)，柱溫：40℃，流速：0.2 mL·min-1，進樣量：1μL。

2.2.2 質譜檢測條件 離子化模式：電噴霧離子化(ESI)，正離子模式；掃描模式：多反應檢測(MRM)；離子噴霧電壓：+4.0KV；ESI源溫度：300℃；脫溶劑溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；霧化氣流速：氮氣，3.0 L·min-1；干燥氣流速：氮氣，10.00 L·min-1；碰撞氣：氬氣。MRM優化參數見表1，圖譜如圖1、2、3所示。

表1 MRM優化參數

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的制備 分別精密量取對照品儲備液適量，稀釋成含肌苷2.04 ng·mL-1、4.08 ng·mL-1、5.44 ng·mL-1、6.80 ng·mL-1、9.52 ng·mL-1、13.60 ng·mL-1和尿苷15.72 ng·mL-1、31.44 ng·mL-1、41.92 ng·mL-1、52.40 ng·mL-1、73.36 ng·mL-1、104.80 ng·mL-1的混合對照品溶液。分別進樣，以峰面積與濃度計算標準曲線。肌苷的回歸方程為Y=2.53207×103X+180.804，R2=0.9941，尿苷的回歸方程為Y=324.641X+2496.57，R2=0.9969。肌苷和尿苷的濃度線性范圍分別在2.04～13.60 ng·mL-1和15.72～104.80 ng·mL-1時，線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 精取肌苷和尿苷濃度分別為6.80 ng·mL-1和41.92 ng·mL-1的對照品溶液連續進樣6次，肌苷和尿苷峰面積的RSD分別為2.73%和2.79%，精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取樣品0.10 g，按“2.1.2”供試品溶液制備方法平行提取樣品6份，按UFLC-MS-MS方法測定面積。結果尿苷的平均含量為1227.7 μg·g-1，肌苷的平均含量為72.94 μg·g-1，RSD分別為2.82%、3.45%。

2.3.4 檢測限和定量限 取尿苷和肌苷對照品儲備液逐級稀釋，至信噪比(S/N)為3和10。此時尿苷的檢測限為1.05 ng·mL-1，定量限為4.51 ng·mL-1；肌苷的檢測限為0.47 ng·mL-1，定量限為1.36 ng·mL-1。

2.3.5 穩定性試驗 取供試品溶液，分別于0、2、4、8 h進樣測定，尿苷和肌苷峰面積RSD分別為1.63%，1.49%。結果供試品溶液在8 h內穩定。

2.3.6 回收率試驗 取6份已測含量的蟬花，分別精密加入尿苷和肌苷對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定峰面積計算回收率。結果尿苷和肌苷的平均回收率分別為91.72%，90.58%，RSD為2.42%、3.70%，表明該試驗方法可靠。見表2。

表2 回收率試驗

2.4 樣品測定 取6批蟬花粉末0.1 g(過四號篩)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，根據回歸方程計算供試樣品的含量。結果見表3。

表3 6批樣品含量測定 (n=3)

3 討論

本實驗對提取方法進行考察，考察溶劑(水、50%甲醇、甲醇)，提取時間(10 min、30 min、60 min)結果選用溶劑水超聲提取30 min，具有操作簡單、含量提取充分。

比較不同的流動相組成(甲醇-水、0.1%甲酸水-甲醇、乙腈-水)，實驗結果顯示以甲醇-水為流動相洗脫時，分離時間短，峰形對稱，檢測靈敏度高。

本實驗測定方法經各項考察,結果表明方法簡便、結果準確，重現性好，能同時測定2種核苷類物質，可為準確測定蟬花中更多核苷類有效成分提供基礎。