市售燈盞花藥材及其提取物HPLC指紋圖譜研究

張 洪 武正才 黃春球 謝忠浪 騰利兵 郭 昕

云南植物藥業有限公司，云南 昆明 650109

燈盞花為菊科植物短葶飛蓬 [ErigeronBreviscapul(Vent.)Hand- Mass.]的干燥全草[1]，又名燈盞細辛，是云南道地的民族藥材。全草具有散寒解表、祛風除濕、活絡止痛、消積的功效，臨床上多用于治療腦血栓、腦栓塞、中風等腦血管意外所致的癱瘓癥、心絞痛等[2]。燈盞花主要成分為燈盞花乙素，此外還含有黃酮、吡喃酮、倍半萜、咖啡酸酯、酚酸類化合物等多種化學成分[3]。

2015版中國藥典以燈盞花乙素的含量作為評價藥材質量的指標。然而，僅控制燈盞花乙素的含量并不能反映燈盞花藥材或提取物的整體質量。指紋圖譜質量控制技術通過全面反映中藥所含內在化學成分的種類與數量，能有效的反映中藥質量[4]。本實驗采用高效液相色譜分析方法對10批市售燈盞花藥材和8批自提燈盞花提取物進行系統的指紋圖譜研究，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(版本2004A和B)”建立燈盞花藥材及其提取物對照指紋圖譜，對各批次的燈盞花藥材及其提取物的指紋圖譜相似度進行分析比較。近年來雖然有一些文獻對燈盞花藥材及其提取物HPLC指紋圖譜進行研究[5-6]，但是這些指紋圖譜僅僅指認了參照色譜峰的結構。筆者對生產用市售燈盞花藥材及燈盞花提取物的HPLC指紋圖譜進一步進行研究，標定其中3個指紋峰的結構，研究結果為市售燈盞花藥材及其提取物的質量評價提供科學參考依據，為市售燈盞花藥材及其提取物提供一種有效的質量控制方法，確保外購燈盞花藥材及其提取物相關產品的穩定性和均一性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1260高效液相色譜儀(四元梯度泵，自動恒溫進樣器，柱溫箱，紫外檢測器)，超聲波清洗儀，中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(版本2004A和B)的相關軟件。

1.2 材料 乙腈(色譜純)，醋酸銨(分析純)，磷酸(分析純)，超純水。燈盞花乙素、燈盞花甲素、野黃芩素對照品(云南植物藥業有限公司研究院自制)。10批燈盞花藥材(云南植物藥業有限公司外購)，8批燈盞花提取物(云南植物藥業有限公司按2015版《中國藥典》一部中燈盞細辛顆粒標準制法提取外購燈盞花所得的提取物)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent zorbax C18(5μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：乙腈(A)，0.1%的醋酸銨水溶液(磷酸條PH為3)(B)，梯度洗脫比例見表1；檢測波長：335 nm；柱溫：25℃；進樣量：5 μL；流速：1 mL/min。

表1 梯度洗脫系統

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取燈盞花乙素對照品適量，加甲醇超聲溶解制成含量為0.140 mg/mL的溶液。精密稱取燈盞花甲素對照品適量，加甲醇超聲溶解制成含量為0.238 mg/mL 的溶液。精密稱取野黃芩素對照品適量，加甲醇超聲溶解制成含量為 0.043 mg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取1 g已粉碎成細粉的燈盞花藥材，加入75%甲醇溶液100 mL，超聲(200 W,50 Hz)45 min,過濾，濾液用0.45 μm的濾膜過濾，即得燈盞花藥材供試品溶液。取燈盞花提取物60 mg置50 mL三角錐形瓶中，精密加入75%的甲醇溶液20 mL，超聲振蕩(200 W,50 Hz)40 min,用0.45 μm的濾膜過濾，即得燈盞花提取物供試品溶液。

2.3 精密度試驗 分別取第6批燈盞花藥材和第4批燈盞花提取物供試品溶液，按2.1色譜條件連續進樣 6 次，每次5 μL，記錄所得到的色譜指紋圖譜，考察共有峰的相對保留時間，以燈盞花乙素色譜峰為參照，計算大于總峰面積10%的共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值，結果表明，同一供試品溶液連續進樣6次的燈盞花藥材和提取物大于總峰面積10%共有峰的相對保留時間 RSD<2%、相對峰面積RSD<3%，表明該方法精密度良好。

2.4 重現性試驗 取第6批燈盞花藥材和第4批燈盞花提取物，按2.2.2中供試品液制備方法分別制備6份供試品溶液，按2.1的色譜條件依次測定，記錄所得到的色譜指紋圖譜，考察共有峰的相對保留時間，以燈盞花乙素色譜峰為參照，計算大于總峰面積10%的共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值，結果表明，燈盞花藥材和提取物各6份供試品溶液大于總峰面積10%共有峰的相對保留時間RSD<2%、相對峰面積RSD<3%，表明該方法重現性良好。

2.5 穩定性試驗 取同一份第6批燈盞花藥材和第4批燈盞花提取物供試品溶液，按2.1的色譜條件，分別于不同的時間進樣，記錄0、2、4、6、8、10、16、24 h所得到的色譜指紋圖譜，考察共有峰的相對保留時間，以燈盞花乙素色譜峰為參照，計算大于總峰面積10%的共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值，結果表明，不同時間進樣的燈盞花藥材和提取物大于總峰面積10%共有峰的相對保留時間 RSD<2%，相對峰面積RSD<3%，表明該方法穩定性良好。

2.6 指紋圖譜的建立 將10份燈盞花藥材的HPLC的指紋圖譜(見圖1)和8份燈盞花提取物的HPLC的指紋圖譜(見圖3)，分別導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(版本2004A)，經軟件將指紋圖譜自動匹配分析，分別生成燈盞花藥材對照指紋圖譜(見圖2)和燈盞花提取物對照指紋圖譜(見圖4)。

2.7 共有指紋峰的確定及結構指認

2.7.1 藥材共有指紋峰的確定 在燈盞花藥材的指紋圖譜中確定10個峰作為特征峰(見圖2)。通過與對照品對照，確定了燈盞花藥材中5號峰為燈盞花乙素，9號峰為燈盞花甲素，選取含量最高且為燈盞花指標性成分的燈盞花乙素5號峰為參照色譜峰。

2.7.2 提取物共有指紋峰的確定 在燈盞花提取物的指紋圖譜中確定12個峰作為特征峰(見圖4)。通過與對照品對照，確定了燈盞花提取物中5號峰為燈盞花乙素，10號峰為燈盞花甲素，12號峰為野黃芩素，選取含量最高且為燈盞花指標性成分的燈盞花乙素5號峰為參照色譜峰。

2.8 相似度的計算

2.8.1 燈盞花提取物的指紋圖譜相似度測定 將10批燈盞花藥材液相色譜圖與對照指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(版本2004B)進行指紋圖譜測定(見圖1)，并計算相似度，評價燈盞花不同外購批次的質量，計算結果見表2。

表2 10批燈盞花藥材相似度表

2.8.2 燈盞花提取物的指紋圖譜測定 將8批燈盞花提取物液相色譜圖與對照指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(版本2004B)進行指紋圖譜測定(見圖3)，并計算相似度，評價燈盞花提取物不同批次的質量，計算結果見表3。結果表明，10 批燈盞花藥材和8批提取物的HPLC圖譜和HPLC對照指紋圖譜對比的相似度均高于 90%，表明 10 批市售燈盞花藥材和8批燈盞花提取物相似性良好，質量較穩定。

表3 8批燈盞花提取物相似度表

3 討論

本實驗采用高效液相色譜法對10批市售燈盞花藥材和8批燈盞花提取物進行HPLC指紋圖譜研究，并分別確定了燈盞花藥材及其提取物中的共有色譜峰，標定了燈盞花藥材和及其提取物中3個共有峰的結構，通過方法學的考察，該方法的精密度較高，重復性、穩定性好，可用于市售燈盞花藥材及其提取物的HPLC指紋圖譜測定，為今后其質量評價提供科學依據。

流動相考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-四氫呋喃-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%的醋酸銨水溶液(磷酸調PH至3)的溶劑系統，結果表明，流動相系統為乙腈-0.1%醋酸銨溶液(磷酸調PH至3)系統梯度洗脫條件下基線平穩，色譜峰分離度好，色譜峰保留時間適宜。

經燈盞花藥材與其提取物HPLC對照指紋圖譜對比發現，燈盞花提取物對照指紋圖譜比燈盞花藥材對照指紋圖譜增加了7號和12號色譜峰，其中12號峰標定為野黃芩素，其為燈盞花乙素的苷元，燈盞花藥材按2015版《中國藥典》一部中燈盞細辛顆粒標準制法提取，其提取方法為75%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇至稠膏狀，即得燈盞花提取物，可能該方法提取濃縮時間受熱較長，燈盞花乙素少量水解成野黃芩素，其它也有成分降解生成化合物7號峰。

由于生產用市售燈盞花藥材來源較廣，品質參差不齊，為了科學評價不同批次外購的市售燈盞花藥材質量的均一性，本實驗所用藥材均為生產用燈盞花藥材，不同批次均從市場上采購而來，每批次采購量均較大，具有生產用燈盞花藥材的代表性。同時對燈盞花進行提取，評價不同批次采購的市售燈盞花藥材提取物的均一性，結果表明10批市售燈盞花藥材及8批自提燈盞花提取物樣品相似性良好，質量穩定。