辣木葉不同極性部位對細胞的抗氧化及抗增殖活性研究

王麗虹，劉陽*，許悅，熊凡，潘敏怡，王語嫣

（1.武昌理工學院生命科學學院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協同創新中心，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術研究中心，湖北 武漢 430223；2.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430073）

人體正常生命活動中會生成自由基，自由基過多或身體自身清除過慢，都會對人體的健康造成一定影響。大量研究顯示，自由基與多種疾病的發展有著密切的關聯[1]。人工合成抗氧劑在食品工業中被廣泛使用，但毒理學和生物學研究發現，人工合成抗氧劑對人體健康安全存在威脅[2-3]。許多研究證實了天然產物中所含的黃酮類物質有抗氧化的功能，因其安全性高，在抗氧劑研發中極具潛力和應用價值[4-5]，因此具有較高的研究價值和開發前景。

辣木（Moringa oleifera Lam）屬于辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa Adans）落葉喬木[6]，為藥食兩用植物，其含有的黃酮含量達到31.28 mg/g。曾有學者對辣木葉醇提物的自由基清除能力進行研究，發現在相同濃度下其抗氧化活性能與人工合成抗氧劑相媲美[7]，這表明辣木葉是一種具有開發潛力的天然抗氧劑原料。有研究發現，辣木葉甲醇提取物減輕了糖尿病大鼠肝臟的炎癥，顯示了肝臟保護作用[8]。辣木葉還具有抗癌的功能，其抗癌活性被證實主要來源于其含有的槲皮素、煙堿甲素[9-11]。前期研究中采用化學方法發現辣木葉不同極性部位均有清除自由基的能力，為進一步研究其抗氧化活性，本文以H2O2誘導HepG2細胞損傷為模型，通過生化分析方法測定細胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力，評價辣木葉不同極性部位的抗氧化能力，并對HepG2細胞的抑制作用進行研究，旨在篩選活性較強的極性部位。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞系HepG2細胞由武漢大學病毒學國家重點實驗室惠贈。

辣木葉：云南大藥山商貿有限公司；纖維素酶（10萬U/g）、果膠酶（5萬U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合溶液、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液：?？寺∩锘瘜W制品（北京）有限公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：上海源葉生物科技有限公司；GSH-Px測定試劑盒、CAT測定試劑盒、MDA測定試劑盒、SOD測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

倒置相差熒光顯微鏡（TE2000-5）：日本尼康公司；二氧化碳培養箱（MCO-15AC）：松下健康醫療器械株式會社；生物安全柜（BHC-1300ⅡB2）：蘇州安泰空氣技術有限公司；高速離心機（HC-3018）：安徽中科中佳科學儀器有限公司；電子分析天平（A223 S-CW）：德國賽多利斯公司；酶標儀（Infinite F200）：瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木葉不同極性部位的制備

稱取干燥辣木葉粉1 g、纖維素酶20 mg、果膠酶40 mg，加入濃度為 88%的乙醇，料液比為 1∶26（g/mL），超聲45 min后置于60℃的水浴鍋酶解25 min，提取辣木葉總黃酮，得總醇提液（M），并按石油醚、乙酸乙酯、正丁醇順序依次萃取，萃取液經旋蒸、干燥，分別制得辣木葉石油醚部位（M1）、乙酸乙酯部位（M2）、正丁醇部位（M3）和水溶性部位（M4），經檢測 M、M2、M3、M4 中總黃酮含量依次為 （100.56±1.49）、（326.19±2.35）、（209.39±1.16）、（45.40±2.11）mg/g，M1 含有極少量的總黃酮，故舍去。試驗時用完全培養基配制成不同濃度無菌溶液。

1.3.2 HepG2細胞復蘇

取出含HepG2細胞的凍存管于37℃水浴鍋中快速解凍，加37℃預熱DMEM高糖培養基混勻，1 000 r/min離心5 min后棄去最上層液體，迅速加入含有血清和雙抗的完全培養基，用移液槍頭輕輕地吹打細胞至完全分散后將其轉移至培養瓶，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中進行培養。

1.3.3 H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷模型的建立

將對數生長期的細胞，用細胞計數板調整細胞數至 1×105個/mL，按 100 μL/孔接種于 96 孔板后于培養箱中培養。待細胞貼壁生長后，棄去原培養基，模型組加入100 μL用完全培養基配制的50 μmol/L～1 000 μmol/L H2O2溶液，正常組和調零組（不添加細胞）分別加入相同體積的完全培養基[12]。每組5個復孔，培養2 h后棄去上層培養液，按10 μL/孔加入5 mg/mL MTT溶液后于培養箱中培養4 h，吸棄上層液加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL/孔，低轉速搖晃10 min使結晶溶解充分，后用酶標儀于490 nm處測定各孔OD值。用公式（1）計算細胞存活率。

1.3.4 辣木葉不同極性部位給藥劑量的篩選

將1.3.3中的H2O2溶液用0.1mg/mL～5.0mg/mL辣木葉不同極性部位溶液代替，培養24 h后按照1.3.3的步驟，加入MTT溶液測定細胞存活率，篩選出對HepG2細胞安全無毒的劑量范圍[13]。

1.3.5 辣木葉不同極性部位對H2O2損傷細胞的保護作用

向模型組中加入安全濃度的辣木葉各極性部位溶液繼續培養24 h后吸去上層液，加入用完全培養基配制的400 μmol/L H2O2溶液，培養2 h后，按1.3.3操作步驟檢測細胞存活率。

1.3.6 細胞氧化酶活力檢測

同1.3.5的步驟，H2O2處理細胞2 h，收集培養液后離心取上清液待測；細胞用冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2次后加入胰蛋白酶-EDTA溶液消化、離心收集，在冰浴中用RIPA裂解液裂解細胞，待測[14]。參照相應試劑盒方法，測定細胞培養液及細胞中MDA、SOD、GSH-Px以及CAT水平。

1.3.7 辣木葉不同極性部位對細胞增殖的影響

依照1.3.4的操作，用MTT法分別檢測辣木葉不同極性部位作用于HepG2細胞24、48、72 h時的存活率，并利用軟件計算半數抑制濃度（IC50，mg/mL）。

1.4 數據處理

試驗結果用平均值±標準差表示，數據采用SPSS軟件進行統計分析，用方差分析法進行顯著性檢驗，繪圖采用Origin Pro 8.0。

2 結果與分析

2.1 H2O2誘導HepG2細胞損傷濃度的確定

H2O2是一種活性氧，是人體新陳代謝過程中的中間產物，它極易穿透細胞膜作用于一些生物大分子，引起脂質過氧化等一系列反應，是建立細胞氧化損傷的常用物質[15]。HepG2細胞因有和人體正常肝細胞相同的功能，所以常被用在探究天然抗氧化活性產物對細胞保護作用的試驗中[16]。不同濃度H2O2對HepG2細胞存活率的影響見圖1。

圖1 不同濃度H2O2對HepG2細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentration of H2O2on the survival rate of HepG2 cells

由圖1可知，H2O2對細胞的氧化損傷隨濃度的增大而增強，當 H2O2濃度為 200、400、800μmol/L 時，HepG2細胞存活率分別為（74.33±2.44）%、（64.73±1.52）%、（35.30±3.10）%。由于低濃度H2O2對細胞損傷較輕，樣品對于細胞的保護作用不明顯；而濃度過大又會對細胞造成不可逆轉的損傷，所以一般應選擇細胞存活率在50%～70%范圍內，便于試驗觀察研究[17]。因此，選擇400 μmol/L H2O2進行后續細胞損傷保護試驗。

2.2 辣木葉不同極性部位對HepG2細胞存活率的影響

為了后續試驗研究辣木葉對H2O2氧化損傷細胞的保護作用，樣品劑量作用于正常細胞必須是安全無毒的。辣木葉不同極性部位對HepG2細胞存活率的影響見圖2。

圖2 辣木葉不同極性部位對HepG2細胞存活率的影響（24 h）Fig.2 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the survival rate of HepG2 cells（24 h）

由圖2可知，在4個樣品濃度均低于1.0 mg/mL時，細胞存活率都大于99%，因此選擇0.1、0.5、1.0 mg/mL這3個劑量來研究H2O2導致HepG2細胞損傷的保護作用。

2.3 辣木葉不同極性部位對HepG2細胞損傷的保護作用

辣木葉不同極性部位對HepG2細胞存活率的影響見表1。

試驗結果顯示，模型組細胞存活率為（64.73±1.52）%，與正常組（99.81±0.41）%相比，存活率顯著下降（P＜0.001），這說明細胞損傷成功。由表1可知，與模型組相比，除M4低濃度組外，其它樣品低、中、高濃度組的細胞存活率均有明顯升高（P＜0.01，P＜0.001），并具有濃度依賴性；濃度相同時，M2對H2O2損傷HepG2細胞的抑制作用最強，M3、M次之，M4最弱；高濃度時（1.0 mg/mL），預先用M2溶液處理HepG2細胞，400 μmol/L H2O2對細胞的損傷較小、存活率達到（92.24±3.22）%，比模型組提高了42%以上，防護作用顯著（P＜0.001）。

表1 辣木葉不同極性部位對HepG2細胞存活率的影響（n=5）Table 1 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the survival rate of HepG2 cells（n=5）

2.4 辣木葉不同極性部位對H2O2導致HepG2損傷細胞酶活力的影響

辣木葉不同極性部位對HepG2損傷細胞酶活力的影響見表2。

由表2可知，與正常組比較，模型組中MDA的含量顯著上升（P＜0.001），其它酶的活力顯著下降（P＜0.001），說明經H2O2處理后細胞氧化損傷造模成功。與模型組比較，辣木葉樣品組預處理后顯著降低了細胞中 MDA 含量（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），細胞內SOD、GSH-Px、CAT 活性顯著升高（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），并具有濃度依賴性，各樣品組使各項指標均趨于正常組細胞的水平。說明辣木葉不同極性部位通過改變細胞內 SOD、GSH-Px、CAT活力，發揮了對HepG2細胞氧化損傷的預保護作用。綜合比較各項指標，各樣品其防護作用強弱順序是：M2＞M3＞M＞M4。

表2 辣木葉不同極性部位對HepG2損傷細胞酶活力的影響（n=5）Table 2 Effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on enzyme activity of HepG2 injured cells（n=5）

2.5 辣木葉不同極性部位對HepG2細胞抑制作用

辣木葉不同極性部位對HepG2細胞抑制率的影響見表3。

表3 辣木葉不同極性部位對HepG2細胞抑制率的影響（n=5）Table 3 The effect of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the inhibition rate of HepG2 cells（n=5）

由濃度篩選試驗結果可知，辣木葉不同極性部位在作用時間較短（24 h）且濃度低于1.0 mg/mL時對細胞無抑制作用。由表3可得，辣木葉不同極性部位在濃度大于1.0 mg/mL時，對HepG2細胞的生長均有抑制作用，且呈濃度、時間依賴性；濃度及作用時間相同時，各極性部位對細胞抑制作用順序為：M2＞M3＞M＞M4。綜合考慮濃度和時間因素，M2的最佳濃度和作用時間分別是2.5 mg/mL、72 h，此時抑制率為（66.47±2.24）%，達到最大濃度時抑制率的87%，繼續增大濃度對抑制率的影響較小。

辣木葉不同極性部位對HepG2細胞不同作用時間下的IC50值見表4。

表4 辣木葉不同極性部位對HepG2細胞增值抑制率的IC50值Table 4 IC50value of inhibition rate of different polar extracts of Moringa oleifera leaves on the proliferation of HepG2 cells

由表4可知，各樣品對HepG2細胞的增殖抑制作用具有明顯的時間依懶性；時間相同時，對HepG2細胞增殖抑制作用順序為：M2＞M3＞M＞M4，與表3結果一致；作用72 h時，M4濃度是M2濃度的2.07倍以上才能達到相同的抑制效果。

3 結論

本試驗采用H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷探究辣木葉不同極性部位對細胞的保護作用，結果表明，利用較低濃度（＜1.0 mg/mL）的辣木葉不同極性部位預處理細胞后，對H2O2誘導HepG2細胞損傷具有明顯的保護作用，其作用順序為M2＞M3＞M＞M4，其作用機制可能與調節細胞抗氧化酶活性相關。增殖抑制試驗結果表明，辣木葉不同極性部位對HepG2細胞增殖抑制作用與濃度和時間呈正相關，抑制作用順序為M2＞M3＞M＞M4，該結果可能與辣木葉不同極性部位中總黃酮含量有關，但其作用機制尚需進一步研究。

綜上，辣木葉乙酸乙酯部位（M2）在濃度較低時對細胞氧化損傷有較好的保護作用，但濃度較高時對肝癌HepG2細胞具有明顯的抑制作用，其IC50值為1.83 mg/mL（72 h），顯示了較強的生理活性，因而可進行后續的分離純化和藥效學研究。