不同劑量納米TiO2對小鼠腸道微生物的影響

董萌，楊晨，史婷婷，楊柳，劉東青，丘漢青，林影，路福平，趙化冰*

（1.天津科技大學生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

二氧化鈦（TiO2）是鈦元素的一種天然氧化物。這種物質在自然界中以3種礦物化合物的形式出現，即銳鈦礦、金紅石和板鈦礦。近年來，TiO2納米粒子由于其良好的理化性能，在涂料、廢水處理、殺菌、化妝品、食品添加劑、生物醫用陶瓷和植入生物材料等領域得到了越來越多的應用[1]。在食品行業中，TiO2作為食品添加劑應用于糖果、奶酪、醬料、脫脂牛奶和冰淇淋等產品中。同時，它也被用作風味增強劑應用于各種非白色食品，包括干蔬菜、堅果、種子、湯、芥末以及啤酒和葡萄酒[2]。此外，TiO2可直接用于與食品接觸的包裝材料，如瓶子、牛奶盒和包裝箔等[3-6]。2012年，Weir等[7]檢測了89種食品的總TiO2含量，結果顯示平均鈦含量達3.59 mg/g。并且研究發現，糖果、口香糖和蛋糕等甜食類副食品中含有更高劑量的TiO2，其中約1/3顆粒的粒徑屬于納米級別。1966年美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）提出，允許將TiO2作為色素添加劑加入食品中，其含量不應超過食品總重量的1%[8]。我國對于食品中TiO2的最大使用量有著嚴格的規定：蛋黃醬、沙拉醬不超過0.5 g/kg，可可制品等不超過2.0 g/kg[9]。但目前缺乏專門針對顆粒形態和粒徑的限制[10-11]。納米TiO2因其體積小、單位質量表面積大、反應活性高等特點，不僅能夠通過食品遷移至人體內，還能夠對人體腸道微生態造成影響，給人類的健康帶來更大的潛在風險。

納米TiO2顆粒進入體循環后，會遷移到各種器官和組織，使人體的腎臟、肺、腦等組織和器官產生病變[12]。納米TiO2的暴露會引起實驗動物的肺部炎癥反應，進而增加肺癌的患病幾率[13]。Ze等研究表明，納米TiO2可以在腦內移位和積聚，導致氧化應激、膠質細胞過度增殖、組織壞死以及海馬細胞凋亡[14]。Gui等報道了納米TiO2在腎臟內積累，可引起腎臟炎癥、細胞壞死和功能障礙[15]。而腸道作為納米TiO2攝入后的停留時間最久的器官，更易受影響。在上皮細胞和動物身上進行的毒性評估表明，納米TiO2可以在腸道內積聚，通過腸道屏障，氧化應激和遺傳毒性誘導毒性，并破壞腸道和全身免疫穩態[16-20]。此外，長期大量口服含納米TiO2添加劑的食品可能會增加直腸癌發生的風險[21]。

腸道微生物組已經是公認的類器官，對人類健康至關重要，在特定條件下，微生物失調可導致多種疾病[22-23]。有研究顯示，納米TiO2可引起腸道菌群失衡，降低雙歧桿菌和乳酸菌兩種典型益生菌的豐度[24]。納米TiO2對腸道微生物的影響與染毒劑量、粒徑、晶型等因素密切相關，所以不同的實驗條件可能會產生相互矛盾的實驗結果。因此，有必要進一步積累相關研究數據，加強對納米TiO2在食品領域應用的安全性及風險的評估。

本研究以C57BL/6小鼠為研究對象，利用不同劑量的納米TiO2懸浮液進行連續灌胃染毒實驗，持續28 d，建立納米TiO2單一亞急性暴露模型，并采用宏基因組學方法探究其對C57BL/6小鼠腸道微生物群落的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

銳鈦礦型納米TiO2：Sigma-Aldrich，粒徑小于25nm。實驗選用三周齡C57BL/6小鼠，24只，雌雄各半，體重18 g～22 g。小鼠飼養在聚丙烯籠中，做好標識。飼養環境溫度保持在20℃～22℃，相對濕度50%～70%，小鼠置于12 h/12 h光照與黑暗交替周期循環的環境中飼養，并保證環境的干凈衛生。

實驗開始前，小鼠需提前適應環境7 d，所有的相關操作按照動物實驗標準規范操作。小鼠被隨機分為4組，分別為對照組和暴露組，連續28 d進行灌胃。暴露劑量分別為10、100、1 000 mg/（kg·BW）。其中，100 mg/（kg·BW）相當于愛吃甜食的青少年的攝入量[25]。對照組每天灌胃同等體積的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）。使用 PBS配制納米 TiO2懸浮液，每次灌胃前進行超聲破碎，并充分振蕩混勻。在飼養期間，每天觀察小鼠的精神狀態、飲食飲水情況及死亡率，每周記錄小鼠的體重。

1.2 儀器與設備

-80℃超低溫冰箱：美國Thermo Scientific Forma公司；SCIENTA-950E超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；恒桂牌DT系列電子天平：常熟市佳衡天平儀器有限公司；TGL-16C臺式離心機：上海安亭科技儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 臟器系數

實驗建模成功后，眼球取血處死小鼠，皮膚用酒精消毒后，立即打開腹腔取其臟器組織，用生理鹽水洗滌兩次，濾紙吸干后稱重，按公式C/%=（m1/m2）×100計算臟器系數。

式中：C 為臟器系數，%；m1為器官濕重，g；m2為小鼠體重，g。臟器組織置于-80℃冰箱保存。

1.3.2 糞便樣品的采集及保存

采樣者佩戴口罩和無菌手套，每周定期用已滅菌的鑷子收集小鼠新鮮糞便（灌胃后2 h取）。稱重后，將糞便平均分成兩份，一份直接放置于-80℃冰箱保存。另一份則放在生理鹽水∶甘油（7∶3，體積比）混合液中振蕩混勻（100 mL混合液中約10 g糞便），放置-80℃冰箱中保存。前者適于短期保存，后者適于長期保存。這樣的方式可以更好的保證糞便中的菌活性。使用QIAampDNA糞便迷你試劑盒，提取細菌總DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，采用分光光度計測量DNA純度及濃度，保存于-20℃冰箱中備用。

1.3.3 腸道微生物組分析

為了探究納米TiO2不同的染毒劑量對小鼠腸道微生物群落的影響，對小鼠腸道微生物進行了16S rDNA基因測序分析。測序部分由深圳華大股份有限公司執行，主要測序實驗過程如下：取質量合格的小鼠糞便DNA樣品及對應融合引物配置聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體系，進行 PCR擴增，建立數據庫。使用Hiseq平臺對16S rDNA的V3～V4區域進行測序，并對結果進行過濾，將高質量的Clean data用于后期數據分析，通過reads之間的重疊關系將其拼接成Tags，并聚類成操作分類學單元（operational taxonomic units，OTU）并與 Greengenes和 R DP 數據庫進行比對和物種注釋。基于上述測序結果進行后續樣品物種復雜度分析，組間物種差異分析等。

1.4 統計學分析

數據分析采用軟件SPSS 16.0處理，各組以變異數ANOVA進行比較分析，數據用均數±標準差（mean±SD）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 納米TiO2對小鼠體重的影響

在整個實驗期間，每周記錄一次小鼠體重。圖1為小鼠連續28 d暴露于不同染毒劑量組的體重增長變化圖。

由圖1可以看出，小鼠的體重均有所上漲。其中，雌性小鼠隨著染毒劑量的增加，體重的增加量整體呈下降趨勢。Chen等對SD大鼠脂質代謝的研究也同樣發現了這種趨勢，大鼠暴露于納米TiO2連續90 d，隨著時間推移，與對照組相比，較大劑量組的大鼠體重增加逐漸變緩[26]。但本實驗中，類似的趨勢在雄性小鼠中并不明顯，考慮可能是由于納米TiO2對雄性小鼠激素水平造成的影響不如對雌性小鼠大，或者是小鼠個體間差異造成的。另外，不排除可能由于攝入納米TiO2而減少了小鼠對營養的吸收，導致了小鼠體重增長緩慢。

圖1 小鼠體重增長變化Fig.1 Changes in weight gain of mice

2.2 納米TiO2對小鼠臟器指數的影響

臟器指數是指實驗動物某臟器的重量與其體重之比。正常時各臟器與體重的比值比較恒定。動物染毒后，受損臟器重量可能會發生改變，所以臟器指數也隨之變化。臟器指數增大，說明臟器充血、水腫或者增生等；臟器指數減少，說明臟器萎縮或者其它病理學的改變[27]。據前人的研究報道，納米TiO2的暴露會對脾臟、腎臟等臟器造成損傷[28-29]。臟器指數見表1。本文研究結果表明，與對照組相比，各染毒組均對小鼠心、肝、脾、肺和腎的臟器指數差異不顯著。這可能是由于暴露方式、劑量不同以及材料本身等差異造成的。雖然本結果表明口服納米TiO2顆粒28 d還不足以引起明顯可見的器官損傷，但是不排除器官功能的惡化。

表1 臟器指數Table 1 Viscera indices

2.3 腸道微生物組分析

2.3.1 α多樣性稀釋曲線

α多樣性稀釋曲線是用來驗證數據量是否足以反映物種多樣性，間接反映樣品的豐富度程度。當曲線趨于平坦時，說明測序深度已基本覆蓋樣品中所有的物種；反之則表示樣品中物種多樣性較高，還存在較多未被測序檢測到的物種。各樣品的稀釋曲線見圖2。

根據研究結果，觀察到香農指數（圖2a）和辛普森指數（圖2b）稀釋曲線隨著序列的增多趨于平緩，表明數據量基本覆蓋了腸道樣本中所有群落物種。

圖2 各樣品的稀釋曲線Fig.2 Dilution curves of each sample

2.3.2 OTU聚類及分析

根據16s rDNA基因測序結果，共獲得1 535 340條序列。其中檢測到對照組（Ti.0）序列383 573條，10 mg/（kg·BW）染毒組（Ti.10）序列382 469 條，100 mg/（kg·BW）染毒組（Ti.100）序列383 898條，1000 mg/（kg·BW）染毒組（Ti.1000）序列385 400條。利用操作分類學單元（operational taxonomic units，OTU）根據rRNA序列相似性對微生物多樣性進行菌株分類。圖3為OTU的比較結果。

圖3 OTU的比較Fig.3 Comparison of OTU

圖中不同顏色圖形代表不同組別，兩兩交疊部分數字為兩組之間共有的OTU個數，多重交疊部分數字為多個組別之間共有的OTU個數。共獲得1 914個OTU，其中對照組482個OTU，10 mg/（kg·BW）染毒劑量組496個OTU，100 mg/（kg·BW）染毒劑量組453個OTU，1 000 mg/（kg·BW）染毒劑量組483個OTU。

2.3.3 α多樣性盒形圖

人和動物腸道內定植著龐大的微生物群體，這些微生物在代謝膳食營養、促進免疫系統發育、抵抗病原微生物入侵等方面發揮重要作用[30]。近年來研究發現，許多的腸道疾病可能與腸道微生物多樣性或者豐度的變化有關。α多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括香農指數、辛普森指數等。其中，香農指數來源于信息熵，指數越大，表明不確定性越大，不確定性越大，則表明群落未知因素越大也就是多樣性高。辛普森指數值越大，說明群落多樣性越低。α多樣性盒形圖見圖4。

圖4 α多樣性盒形圖Fig.4 α diversity box diagram

比較群落的物種多樣性后發現，與對照組相比，10、100、1 000 mg/（kg·BW）的染毒劑量組的香農指數升高（圖4a），辛普森指數降低（圖4b），這表明攝入不同劑量的納米TiO2均有可能導致動物腸道微生物群落物種多樣性的增加。并且隨著納米TiO2攝入劑量的增加，物種的多樣性也隨之增加。這與Li等[31]的研究結果相似。

2.3.4 納米TiO2對小鼠腸道微生物菌落組成的影響

為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析。各樣品的物種豐度柱狀圖見圖5。通過物種柱狀圖直觀地展示了由門到種各樣本物種組成及比例，反映了樣本間物種的變化情況。比較了微生物組在門和屬水平上的組成。

基于門水平上的微生物菌落結構進行分析，共發現4個主要菌門，分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和變形菌門（Proteobacteria）。與對照組相比，隨著納米TiO2染毒劑量的增加，疣微菌門和變形菌門的相對豐度減少，厚壁菌門的相對豐度增加。此前有研究表明，小鼠腸道菌群失調，腸道內變形菌門數量會減少，厚壁菌門數量會增加[32]。并且，變形菌門的增加是腸道損傷和腸道功能障礙的常見現象[33]。

圖5 各樣品的物種豐度柱狀圖Fig.5 Histogram of species abundance of samples

此外，部分小鼠攝入納米TiO2后，腸道菌群中出現TM7細菌（圖5a）。有研究表明，TM7細菌在人類結腸中存在，可能在具有環境影響的炎癥性胃腸疾病中扮演炎癥促進因子的角色[34]。

基于屬水平上的微生物菌落結構進行分析，暴露組的小鼠腸道中出現了微生物群落的共同適應，包括梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、薩特氏菌屬（Sutterella）和阿爾曼菌屬（Akkermansia）的相對豐度減少，普雷沃氏菌（Prevotella）的相對豐度增加（圖5b）。其中，普雷沃氏菌可在某些葡萄糖代謝中發揮作用，促進糖原的儲存，從而導致血糖增加[35]。阿爾曼菌是從人糞便樣品中分離出的一種細菌，也是目前唯一可培養的疣微菌門腸道微生物。有多項研究發現，在人類許多疾病中（如炎癥性腸病、孤獨癥、肥胖等）阿克曼菌豐度均減少[36-38]。

綜上所述，研究結果支持了以下觀點：攝入納米TiO2可能會改變腸道微生物區系結構，且隨著納米TiO2染毒劑量的增加，對小鼠腸道產生了一定的消極影響。

2.3.5 小鼠腸道微生物菌群物種差異分析

為了確定微生物標志物，通過LEfSe分析（LDA>2）檢測到由門到種共17種細菌顯示出統計學差異。在分支進化圖中，由內至外每一圈代表一個層級，依次為門、綱、目、科、屬水平。小圓圈直徑和相對豐度大小成正比。LEfSe分析聚類圖見圖6。

如圖6所示，對照組、Ti.10組、Ti.100組和Ti.1000組之間有17個顯著差異的生物類群。其中4個菌在對照組富集，包括Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Bifidobacteriaceae（雙歧桿菌科）、Bifidobacteriales（雙歧桿菌目）、Actinobacteria（放線菌）；5個菌在Ti.10組富集，包括Bacteroidales（擬桿菌屬）、Bacteroidia（擬桿菌目）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Coprococcus（糞球菌屬）、Desulfovibrio（脫硫弧菌屬）；4個菌在Ti.100組富集，包括 Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）、Prevotella（普氏菌屬）、Enterococcaceae（腸球菌科）、Enterococcus（腸球菌屬）；4個菌在Ti.1000組富集，包括Helicobacteraceae（螺桿菌科）、Flexispira（螺桿菌屬）、Campylobac terales（彎曲菌目）、Epsilonproteobacteria（ε-變形細菌）。由此可以看出，隨染毒劑量的變化，所富集的具有代表性的微生物各不相同。

圖6 LEfSe分析聚類圖Fig.6 LEfSe analysis cluster diagram

在對照組中腸道有益菌雙歧桿菌（Bifidobacterium）起重要作用。在Ti.100組中，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）富集。普雷沃氏菌通常與慢性炎癥相關，在炎癥性腸病患者糞便中相對豐度較高[39-40]。而幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）在Ti.1000組影響較大。幽門螺旋桿菌是慢性幽門螺旋桿菌胃炎、消化性潰瘍等疾病的致病因素之一。上述結果表明了納米TiO2可能會誘發小鼠胃腸道炎癥，增加小鼠患病風險。

3 結論

食品添加劑的不當使用會給人體健康帶來很多潛在的危害。納米TiO2作為常見的食品添加劑，對人體的影響不容忽視。TiO2納米顆粒在奶酪、糖果和布丁等食物中的廣泛存在極大地增加了它們的攝取和積累，特別是在年輕人中。腸道作為人體吸收食物營養的第一道關卡，易受外源性物質的影響。納米TiO2對腸道微生物的影響十分復雜，其毒理機制也尚不清楚。因此，研究納米TiO2對小鼠腸道微生物的影響，不僅是重要的科學問題，也是食品行業健康可持續發展的基礎和重要保障。

本文針對不同劑量的納米TiO2對小鼠進行單一亞急性暴露染毒實驗，闡述了納米TiO2對腸道微生態的潛在影響。口服是人類接觸日常環境中存在的納米顆粒的主要途徑，所以選定的給藥方式是口服灌胃給藥。對于染毒劑量，選擇了相當于喜歡糖果和巧克力的兒童的攝入量。研究結果表明，納米TiO2增加了小鼠腸道微生物群落的多樣性。且隨著染毒劑量的增加，小鼠腸道微生物群落組成也隨之變化，主要表現為厚壁菌門相對豐度增加，雙歧桿菌屬和擬桿菌屬相對豐度減少。在100 mg/kg·BW和1 000 mg/kg·BW的暴露組中，普雷沃氏菌和幽門螺旋桿菌的相對豐度顯著增加。結果表明納米TiO2顆粒會改變人體腸道微生物區系，并可能會增加胃腸道疾病的患病幾率。

本研究結果顯示納米TiO2會對腸道菌群相對豐度產生不同程度的影響，這為TiO2納米顆粒的進一步的安全應用提供了參考依據。然而，對于慢性攝入納米TiO2的累積效應以及高濃度納米TiO2對腸道微生態的影響尚不明確。并且，市面上納米材料種類繁多，暴露的途徑、時間等不確定性都給人類健康帶來威脅。因此，對有關含有納米材料生物安全性再評價的研究工作刻不容緩。