木薯葉抗氧化能力與總黃酮含量及其關系研究

王定美，陳新富，麥力文，楊霞，林蕊，李勤奮*

（1.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南 海口 571101；2.海南省熱帶生態循環農業重點實驗室，海南 海口 571101；3.海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院，海南 海口 571199）

氧化應激使有機體處于易損狀態，可引起有機體抗氧化系統崩潰、衰敗，甚至產生重大疾病死亡及食物腐敗等多方面不良影響。如何抗氧化已成為醫藥保健、水產畜禽養殖、食品加工領域面臨的關鍵課題。目前，使用外源抗氧化劑維持機體抗氧化系統的平衡，被認為是克服氧化應激危害的有效方式[1]。其中，植物來源的天然抗氧化劑還具有來源可靠、安全性高、副作用低等諸多優點，受到廣泛關注[2]。世界衛生組織估計，地球上80%的居民依賴傳統藥物滿足初級保健需求，這種療法大多數依賴于植物提取物及其有效成分的使用[3]。因此，篩選具高抗氧化活性的植物品種資源，并研究其抗氧化活性特性與活性成分的關系，對進一步開發安全高效的抗氧化劑具有重要意義。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是與馬鈴薯、番薯并稱為世界三大薯類的重要的熱帶作物之一，為世界第五大糧食作物，在全世界熱帶地區廣泛栽培。木薯屬于大戟科，此科植物多供藥用，具有抗癌、抗菌、保肝和抗炎等功效[4]。已有研究表明，木薯葉經搗爛、煮熟后，不僅可以作為蔬菜食用，可以治療膀胱炎，并且孕婦和哺乳期的婦女都可以食用[5]。木薯葉中還富含黃酮、胡蘿卜素、三萜類等生物活性物質[6-8]，前人研究表明了木薯葉乙醇提取物中的總黃酮比維生素C表現出更強的抗氧化活性[9]，并已作為畜禽水產養殖飼料添加劑進行應用[10-11]，極具研究開發價值。

目前，我國木薯種植主要以收獲塊莖為主，而占薯塊根產量約30%木薯葉片副產物，除少部分作低附加值飼料外，大部分被丟棄，尚未得到充分開發利用[12]。研究還表明，植物抗氧化活性受品種、植齡等多種因素的影響[13-14]。但目前關于木薯葉提取物的抗氧化活性及成分的僅局限于單個品種的抗氧化活性評價、提取物成分的研究分析及總黃酮含量的動態分析[15-17]，而關于不同品種、不同植齡的互作影響，仍未見報道。因此，本研究基于前人研究進展，假設木薯葉乙醇提取物的抗氧化性與總黃酮含量存在顯著關系，選取9個葉片產量較大的木薯品種的3個植齡的葉片乙醇提取物作為研究對象，檢測提取物中總黃酮含量及抗氧化活性，探討品種和植齡對總黃酮含量與抗氧化活性及其相關關系的影響，以期將木薯葉片開發為抗氧化劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用樣品共27個，分別為9個木薯品種（華南 系 列 品 種 SC06、SC07、SC08、SC09、SC10、SC12、SC13、SC205 及面包木薯品種 BC） 的 120、180 、240 d植齡的葉片樣品，按“品種-植齡”進行編號，如SC06-120，表示木薯品種SC06的120 d植齡葉片樣品。木薯品種來自海南省儋州市的農業農村部木薯種質資源圃，葉片樣品采自海南省海口市三江鎮美達農園農場種植基地，洗凈后經60℃烘干至恒重，粉碎至粒徑0.3 mm，-20℃保存備用。

標準品蘆丁（含量≥98.1%，批號：1022799）：中國食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本東京化成工業株式會社；Fe3+-三吡啶三嗪（TPTZ）：比利時Acros organics公司，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司；ME204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；JL-721DTH數控超聲波清洗器：南京科捷分析儀器有限公司；HACH DR 6000紫外可見光分光光度計：美國哈希公司。

1.3 方法

1.3.1 木薯葉乙醇提取物制備

參考文獻[9]，采用超聲波輔助法制備木薯葉乙醇提取物，具體為：精確稱取1 g樣品于50 mL帶螺旋紋的離心管中，加入40 mL 90%的乙醇提取液。以優化的超聲波輔助法進行提取，提取條件為：超聲功率90 W，提取溫度70℃，提取時間20 min。提取液分裝于離心管中，-20℃保存作為待測母液備用。

1.3.2 木薯葉總黃酮含量測定

精密稱取10.0 mg蘆丁標準品，以70%的乙醇溶液溶解并定容至25 mL，制得0.4 mg/mL的標準液。分別向 10 mL 比色管中加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL蘆丁標準液，并用70%乙醇補充體積至5mL，加入0.3 mL質量濃度為5%的NaNO2溶液，混勻后反應6 min，加入0.3 mL質量濃度為10%的Al（NO3）3溶液，混勻后反應6 min，加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，混勻后反應10 min，加70%乙醇至10 mL。以70%乙醇為參比，于510 nm下比色。以0.4 mL提取液母液代替蘆丁標準液進行樣品測試，3個平行。根據標準曲線獲得的回歸方程，計算木薯葉總黃酮含量[18]。

1.3.3 DPPH自由基清除率測定

參考文獻[19-20]，吸取經梯度稀釋后的待測母液1 mL于2 mL的離心管中，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇液1 mL，搖勻后暗處反應30 min，于517 nm下比色。同時以無水乙醇代替樣品同程序操作測定溶劑空白，以無水乙醇代替DPPH乙醇液同程序測定樣品空白。DPPH自由基清除率按下述公式計算。

式中：A0為1 mL DPPH乙醇液與1 mL無水乙醇在517 nm處的吸光度；A1為1 mL樣品液與1 mL DPPH乙醇液在517 nm處的吸光度；A2為1 mL樣品液與1 mL無水乙醇在517 nm處的吸光度。

將各種濃度的母液待測液DPPH自由基清除率數據，導入Origin 2018，通過最優模型計算DPPH自由基清除率為50%時的母液濃度，記為EC50。

1.3.4 FRAP測定

參考文獻[19-20]，以不同濃度的FeSO4溶液在590 nm下的吸光度制得工作曲線。精密吸取提取液0.3 mL于小試管中，加入預熱至37℃的TPTZ工作液2.7 mL，搖勻后放置10 min，于590 nm測其吸光度值，以無水乙醇代替樣品加入TPTZ工作液為空白，每個濃度做3次，求平均值。根據所得吸光值，在工作曲線上求得相應Fe2+當量，定義為FRAP值。FRAP按下述公式計算。

式中：C為樣品扣除空白后的吸光度代入回歸方程得到的Fe2+當量，μmol/L；V為待測液總體積，取3 mL；N為樣品稀釋倍數；M為樣品質量，g。

1.4 數據分析

采用EXCEL 2010軟件進行數據整理和計算。采用SPSS 25軟件進行差異顯著性分析、聚類分析與相關性分析。

2 結果與分析

2.1 木薯葉總黃酮含量

各樣品的總黃酮含量如圖1所示，木薯葉總黃酮含量在植齡與品種間變異程度分析見表1。

圖1 各品種不同植齡木薯葉中總黃酮含量Fig.1 Total flavonoids contents in cassava leaves of different cultivars at different cultivation time

表1 木薯葉總黃酮含量在植齡與品種間變異程度分析Table 1 Variation degree analysis of total flavonoids contents in cassava leaves among cultivation times and cultivars

續表1 木薯葉總黃酮含量在植齡與品種間變異程度分析Continue table 1 Variation degree analysis of total flavonoids contents in cassava leaves among cultivation times and cultivars

由圖1可知，木薯葉總黃酮含量存在顯著差異，受品種和植齡共同影響。120 d植齡下品種SC12、BC、SC08、SC09、SC13、SC205間，180d植齡下品種 SC12、BC、SC08、SC09、SC13 間，240 d 植齡下品種 SC12、BC、SC13間，葉片總黃酮含量差別不顯著（P>0.05），并顯著高于同一植齡下的其它品種，總黃酮含量存在明顯的基因型差異。其中，SC12、BC、SC13的葉片總黃酮含量均處于各個植齡下最高水平；其總黃酮含量隨植齡的變異系數分別是10.77%、8.60%、8.14%，為各品種中最小，穩定性好，可進一步開發為富含黃酮的木薯品種。

由表1可知，隨植齡增大，總黃酮含量平均值呈逐漸下降變化、各品種間的變異系數呈逐漸增大變化。這種變化規律與王偉等[15]、王琴飛等[17]的研究結果一致。這可能與木薯各生長階段的生長策略有關。120 d處于木薯地上莖葉生長高峰期，各品種葉片生長茂盛、葉片中黃酮等成分大量積累；180 d處于木薯塊根伸長膨大和淀粉積累充實時期，葉片合成的大量營養物質逐步被用于維持地下部生長，葉片中黃酮等成分累積減少；240 d處于木薯塊根營養物質積累完成期，并且由于處于冬季，葉片代謝減弱，趨于變黃掉落，黃酮等成分累積更少。

2.2 提取物抗氧化活性表征

2.2.1 還原力測定結果

FRAP法通過測定化合物的還原能力來表征其抗氧化活性，FRAP值越大，抗氧化活性越強。圖2為不同植齡下各品種木薯葉FRAP抗氧化能力測定結果。

由圖2可知，不同植齡下同一品種的FRAP值差別不大，但不同品種的FRAP值差別顯著，各植齡下各品種的FRAP值差別顯著程度均為SC12、SC13＞BC、SC205＞SC06、SC07、SC08、SC09、SC10（P＜0.05）。說明木薯葉的FRAP抗氧化能力不受植齡影響，存在明顯的基因型差異，品種SC12、SC13具有較強的FRAP抗氧化活性，達到20 mmol/g以上。

圖2 不同植齡的木薯葉FRAP抗氧化活性測定結果Fig.2 FRAP antioxidant activity of cassava leaves at different cultivation times

2.2.2 DPPH自由基清除結果

結合對DPPH自由基的清除率測定結果，計算50%清除率下的提取液濃度EC50值，表征抗氧化活性，EC50值越小，抗氧化活性越強，各樣品的EC50值如圖3所示。EC50值在植齡與品種間變異程度分析見表2。

由圖3、表2可知，品種和植齡對EC50的影響程度不一，9個品種的EC50平均值在各植齡下分別是120 d（22.65%）≈180 d（22.33%）＞ 240 d（17.94%），EC50值的品種間變異系數分別是120 d（13.95%）、180 d（18.06%）、240 d（29.12%），DPPH 自由基的清除力較高（EC50小于20%）的樣品數量分別是120 d和180 d下均為2個、240 d為4個，說明植齡越大，DPPH自由基清除能力與品種間的差別程度均增大，這與總黃酮含量變化規律一致。同一品種下，隨植齡增大，各品種EC50的變異系數處于3.43%～29.79%，離散程度不一。植齡和品種共同影響木薯葉DPPH自由基的清除能力。其中，品種SC12、SC13在各植齡下，DPPH自由基清除能力均處于較高水平，但SC12隨植齡的變異系數為7.68%，明顯低于SC13隨植齡的變異系數25.24%，DPPH自由基的清除能力，SC12比SC13穩定。

圖3 不同植齡的木薯葉DPPH法抗氧化活性測定結果Fig.3 DPPH free radicals scavenging ability of cassava leaves at different cultivation times

2.3 木薯葉乙醇提取物樣品聚類分析

為進一步挖掘木薯品種間的差異，根據木薯葉總黃酮含量和抗氧化活性指標，通過聚類分析法對其進行分類，采用組間平均聯結法，以歐氏距離作為測度方法，結果見圖4。

表2 EC50值在植齡與品種間變異程度分析Table 2 Variation degree analysis of EC50 in cassava leaves among cultivation times and cultivars

由圖4可知，所有樣品被分成5類：Ⅰ類包括SC08-240、SC10-240、SC06-180、SC06-120、SC07-180、SC10-180、SC205-180、SC09-180、SC09-240、SC205-240；Ⅱ類包括 SC06-240、SC07-240；Ⅳ類包括 SC07-120、SC08-180、SC10-120、BC-180、SC08-120、SC09-120、SC205-120、BC-120；Ⅴ類包括 SC12-240、BC-240、SC13-240、SC13-120、SC12-180、SC13-180；Ⅵ類包括SC12-120。同一植齡的樣品沒有都處于一個聚類之中，說明不同品種的樣品具有一定的內在相似性。結合圖1、圖2、圖3可知，總黃酮含量高、抗氧化活性大的樣品基本處于一個類別里，5類樣品總黃酮含量與抗氧化活性大小排序為：Ⅴ類、Ⅵ類＞Ⅳ類＞Ⅰ類＞Ⅱ類，Ⅴ類、Ⅵ類中所含樣品可做為進一步開發為抗氧化劑的對象。進一步從品種篩選考慮，SC12、SC13在各個植齡均具有較高的總黃酮含量及抗氧化活性，這兩個品種作為天然植物抗氧化劑開發的潛力最大。這與前文分析結果一致，這也預示著建立統一的基準，用于評價不同品種抗氧化活性是可行的。

2.4 總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

為進一步明確不同品種木薯葉抗氧化活性與其總黃酮含量的關系，對不同植齡的木薯葉乙醇提取物中總黃酮含量與抗氧化活性進行相關性分析，結果見表3。

由表3可知，總黃酮含量與鐵離子還原能力FRAP值在240 d植齡和全植齡下存在顯著正相關關系（P<0.05），相關系數分別為 0.797、0.423；總黃酮含量只有在240 d植齡下與DPPH自由基清除力的EC50值存在顯著負相關關系（P<0.05），相關系數為-0.748；其他植齡下，總黃酮含量與抗氧化活性指標之間不存在顯著相關關系。分析原因是：1）本研究采用的120、180 d植齡的木薯葉乙醇提取物中，總黃酮類物質并不是唯一起抗氧化作用的物質，可能存在黃酮以外具有抗氧化效果的多酚類物質；2）木薯葉中黃酮類物質存在多樣性，不同成分的抗氧化作用機理不一，多種黃酮類化合物的抗氧化作用效果相互抵消。由以上分析，240 d植齡下，總黃酮是木薯葉乙醇提取物的主要抗氧化活性成分，并且各黃酮成分抗氧化作用效果表現出協調正作用。但木薯葉乙醇提取物中的其他抗氧化活性成分及其抗氧化相互作用機理，仍需進一步研究。

圖4 9個品種3個植齡的木薯葉樣品的聚類分析結果Fig.4 Cluster analysis result of cassava leaf samples from 9 cassava cultivars at three cultivation times

表3 不同植齡木薯葉總黃酮含量與抗氧化活性的Pearson相關分析Table 3 Pearson correlation analysis of total flavonoids content and antioxidant activity of cassava leaves at different cultivation times

3 結論

木薯葉乙醇提取物中總黃酮含量、抗氧化活性受品種、植齡的影響不一。在各植齡下，品種SC13、SC12的總黃酮含量最高，FRAP值最大、DPPH自由基清除率的EC50值最小，抗氧化活性最強，是天然抗氧化劑的良好來源。

聚類分析將不同品種不同植齡的樣品分為5類，揭示了不同品種之間具有內在的相似性，與總黃酮含量水平、抗氧化活性評價結果一致，預示著建立統一的基準，用于評價不同品種抗氧化活性是可行的。

240 d植齡下，木薯葉乙醇提物抗氧化能力與其中總黃酮物質有顯著的相關性，但乙醇提取物中抗氧化組分及其其抗氧化相互作用機理仍需進一步研究。