黑木耳銀耳山楂復配對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響

楊新，白利琴，李研東，趙丹丹，劉新明，陶清泉，郝建雄，陳浩然，牟德華，李丹丹，韓雪*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省獸藥監察所，河北 石家莊 050000；3.承德神栗食品股份有限公司，河北 承德 067600；4.承德本多寶生物科技有限公司，河北 承德 067600）

高脂血癥是指人體中脂質代謝異常，血漿里脂質中的一種或多種成分的濃度超過正常高限的病癥。現代醫學認為造成心腦血管疾病的直接原因是動脈粥樣硬化，而高血脂和脂質代謝紊亂是動脈粥樣硬化形成的主要動因，最終引發腦出血、血栓和心肌梗塞而導致死亡[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活習慣的改變，我國高脂血癥的發病率明顯增加，患者逐漸趨向年輕化。臨床上常采用貝特類藥和他汀類藥預防和治療高脂血癥，效果良好，但難免有副作用[2-3]。因此，在無副作用的前提下，預防血脂代謝異常，防治高脂血癥，乃至預防心腦血管疾病，具有重要的理論價值和現實意義。

黑木耳（Auricularia auricular）是一種藥食兩用的真菌，黑木耳的生物活性主要來自其中的多糖，黑木耳多糖具有抗氧化活性、抗凝血活性、降低血糖、降血脂、抗腫瘤、抗凝血、抗輻射等多種生物活性，并且可以改善健康[4]。銀耳是一種經濟價值高，營養豐富的膠質食用菌和藥用菌[5]，粗多糖是銀耳主要的功能性成分，據國內外的藥理作用研究，銀耳多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗潰瘍、促進蛋白質合成、抗病毒、促進神經細胞生長及改善記憶力等多方面的活性[6]。山楂一直被當作為“藥食同源”的上等補品，山楂果實已被中華人民共和國衛生部批準為功能性食品原料，并已被中國藥典收錄為中草藥[7]。山楂含有多種生物活性物質，其中多酚是一類最重要、最有效的成分。關于黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮提取物的降脂作用研究已有大量的文獻報道，但是對這3種物質進行混合配比，研究其整體對實驗體的血脂及抗氧化等生物物理指標的影響鮮有報道。

本研究采用高脂飼料喂養大鼠并建立大鼠高脂血癥模型，對大鼠進行預防性治療，首次將黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮提取物三者進行復合配制，主要對其關于降血脂功效進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級雄性Wistar大鼠：河北醫科大學實驗動物中心，體質量（200±20）g，許可證 SCXK（冀）2018-004；黑木耳、銀耳、山楂：市售；血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、血清甘油三酯（triglyceride，TG）、血清高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDLC）、血清低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷草轉氨酶（aspartate amino transferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；考馬斯亮藍G-250、乙醇、濃硫酸、4%多聚甲醛通用型組織固定液、氯化鈉注射液等（分析純）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

高速萬能打粉機（FSJ302-5）：天津市泰斯特儀器有限公司；超聲波發生裝置（KQ2200）：昆山市超聲儀器有限公司；離心機（LXJ-IIB）、電子天平（FA2204B）：上海市安亭電子儀器廠；酶標儀（S/N601-1037）：德國BMG；旋轉蒸發儀（RE52CS-1）：上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風干燥箱（GZX-9070）、生化培養箱（BSP-250）：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；超低溫冰箱（902）：Thermo Fisher Scientific；組織勻漿機（JX-24）：上海凈信實業發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取物的制備

黑木耳多糖、銀耳多糖采用水提醇沉的方法進行提取[8]，山楂黃酮用乙醇進行提取[9]。

1.3.2 飼料配方

高脂飼料配方：基礎飼料78.8%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1%、膽酸鹽0.2%[10]。

1.3.3 動物分組、給藥及處理

所有動物飼養一周適應環境，根據體重將大鼠隨機分為10組，對大鼠進行預防性治療，在自由采食高脂飼料的同時進行灌胃，連續給藥5周，具體處理方式見表1。

表1 實驗設計方案Table 1 Experimental design scheme

在第35天禁食12 h后，大鼠股動脈取血，3000r/min離心15 min分離出血清，用于血脂指標和抗氧化指標的測定。解剖大鼠，迅速取出腦、心臟、脾臟及腎臟，剔除其表面的脂肪膜，用生理鹽水沖洗干凈，用濾紙將水分吸去，然后稱重，置潔凈塑料盒內密封，血清和各臟器保存于-80℃冰箱，備用。

1.3.4 檢測指標

1.3.4.1 體重及采食量

每周記錄動物體重及采食量。

1.3.4.2 血清中各生化指標測定

將各組大鼠血清按照每種試劑盒的說明書規范操作，檢測以下生化指標：TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、CAT、SOD、GSH-Px、ALT 和 AST，并可根據公式計算出動脈硬化指數（AI）值：AI=TC-（HDL-C）/HDL-C[11]。

1.3.4.3 腦、肝臟組織抗氧化指標檢測

按照試劑盒說明書操作步驟，測定腦、肝臟組織中MDA含量、CAT活性、SOD活性和GSH-Px活性。

1.3.4.4 臟器系數計算

臟器系數（%）=臟器質量×100/大鼠體重

1.3.4.5 脂肪濕重和脂肪系數

動物取血后，解剖剝離其腎周及生殖器周脂肪組織，稱脂肪重量，計算脂肪系數。

脂肪系數/%=脂肪濕重（g）/體重（g）×100

1.3.4.6 肝臟組織病理學的檢查

取相同部位（肝小葉）大鼠肝臟浸泡至4%多聚甲醛固定液中，然后進行脫水、石蠟包埋并切片，HE染色后放置于光學顯微鏡下，觀察其結構和變性。

1.4 統計分析

實驗數據采用Excel和SPSS19.0進行統計分析，數據用均數±標準差（±s）表示，組間比較并進行Duncan’s檢驗，P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮復配物對大鼠體重增量、飼料采食量的影響

黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠體重增量、飼料采食量的影響見表2。

表2 黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠體重增量、飼料采食量的影響Table 2 Effect of extract on Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on body weight gain and feed intake of rats

由表2可知，與高脂模型相比，單劑量組和低中高復配物組體重增量有降低的趨勢，但是差異并不顯著（P＞0.05），中高劑量復配物組比單劑量組體重增量降低趨勢更明顯，中高劑量復配組體重增量僅為68.8 g和72.56 g，各組之間采食量幾乎沒有差異。模型組體重增量與空白組相比，顯著升高（P＜0.05），說明長期食用高脂飼料會造成大鼠體重較為明顯的增長。與Zou等[12]、靳振剛等[13]的研究結果一致。

2.2 黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮復配物對大鼠脂肪組織的影響

黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠脂肪系數的影響見表3。

表3 黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠脂肪系數的影響Table 3 Effect of extract Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on fat coefficient of rats

與空白組比較，模型組的附睪脂肪系數、腎周脂肪系數和總脂肪系數均有增加，且有統計學意義（P<0.01或P<0.05）。與模型組相比，非諾貝特組與高劑量復配物組對腎周脂肪系數具有降低作用，且具有極顯著性差異（P<0.01），分別降低了22%、21.3%；銀耳多糖組、山楂黃酮組、低劑量復配物組對腎周脂肪系數也具有降低作用，且具有顯著性差異（P<0.05）。

與模型組相比，各組的附睪脂肪系數均有降低，高劑量復配物組較單劑量及低中劑量復配物組降低效果更明顯，下降21.5%，具有極顯著性差異（P<0.01）。與模型組相比，各組的總脂肪系數均有降低，但只有非諾貝特組與高劑量復配物組的差異具有統計學意義（P<0.05），僅為3.85%、3.83%，由此可以說明高劑量組復配物可能有減肥作用。

2.3 黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮復配物對大鼠臟器系數的影響

黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠肝臟系數的影響見表4。

表4 黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠肝臟系數的影響Table 4 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on liver coefficient in rats

肝臟和脾臟系數增大，這表明喂養高脂飼料會造成大鼠肝損傷和脾損傷[14]。與空白組相比，模型組肝臟系數增加，且具有顯著性差異（P＜0.05）；非諾貝特組肝臟系數增加更為明顯，具有極顯著性差異（P<0.01），說明此藥物在降低血脂的同時，對肝臟產生明顯的損害作用。與模型組相比，高劑量復配物組肝臟系數具有顯著性差異（P＜0.05），降低了11.9%。相比于模型組，辛伐他汀組、單劑量組、低中高劑量復配物組大鼠的脾臟系數明顯降低，且高劑量復配物組脾臟指數降低顯著，降低了20.8%。隨著劑量的增加，實驗組大鼠的肝臟和脾臟指數逐漸減小，體現出了一定的劑量依賴性。這與目前相關研究結果一致，在張名位[15]、肖新峰等[16]研究中，高脂飼料都顯著提高了受試動物的肝臟和脾臟系數。本研究中各組大鼠心臟、腎臟系數均無顯著差別，說明各組大鼠內臟并無嚴重受損，這與陳桂林[17]對絞股藍降血脂功能的研究中出現的結果相似。

2.4 黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮復配物對大鼠血脂水平的影響

黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠血脂水平的影響見表5。

表5 黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠血脂水平的影響Table 5 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on serum lipid level in rats

各劑量對實驗大鼠的血脂水平具有不同程度的影響。與空白組比較，模型組的TC、TG、LDL均顯著性提高（P＜0.01），HDL 顯著性降低（P＜0.01），說明高脂模型組大鼠造模成功。與模型組相比，單劑量組、陽性對照組、低中高劑量復配物組的TC、TG均顯著降低，非諾貝特組、中高劑量復配物組較模型組相比TC含量分別降低了28.9%、24.1%、23%。高劑量復配物組、辛伐他汀組較模型組相比TG含量分別降低了36.2%，30.5%。可見復配物對血脂的影響呈現一定的劑量依賴性。

與模型組（0.45±0.10 mmol/L）相比，只有辛伐他汀組（0.60±0.07 mmol/L）與高劑量復配物組（0.63±0.10 mmol/L）HDL-C 的含量顯著升高（P＜0.05），其余組有升高的趨勢，但差異不具有統計學意義（P＞0.05）；只有非諾貝特組與中劑量復配物組LDL-C的含量顯著降低，其余組有降低的趨勢，但差異不具有統計學意義（P＞0.05）。

隨著大鼠血脂的改變，各組大鼠的AI值均出現了不同的變化。模型組的值高達4.38±1.51，具有較高的動脈粥樣硬化風險，通過給藥治療后，低中高劑量復配物組大鼠的AI值分別下降了30.8%、30.1%、41.6%。而單劑量組只有黑木耳多糖組呈顯著性降低，山楂黃酮組、銀耳多糖組均沒有顯著性差異，說明黑木耳銀耳山楂提取物復配很可能有降低實驗大鼠患動脈粥樣硬化的風險。

2.5 黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮復配物對大鼠抗氧化水平的影響

2.5.1 肝臟抗氧化能力分析

黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠肝臟抗氧化能力的影響見表6。

表6 黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 6 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on antioxidant capacity of rat liver

如表6所示，模型組大鼠肝臟MDA含量顯著高于空白組（P＜0.05），CAT活性和GSH-Px活性顯著低于對照組（P<0.05），SOD活性雖低于空白組，但沒有統計學差異（P>0.05）。山楂黃酮單劑量組、低、高劑量組肝臟GSH-Px活性顯著高于模型組。各組大鼠肝臟CAT、SOD活性雖然差別很大，但因為個體差異較大而無統計學意義。與模型組相比，非諾貝特藥物組CAT活力顯著增強，MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

2.5.2 血清抗氧化能力分析

黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠血清抗氧化能力的影響見表7。

表7 黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠血清抗氧化能力的影響Table 7 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on antioxidant activity of rat serum

如表7所示，模型組大鼠血清CAT活性極顯著低于空白組（P<0.01），SOD活性顯著低于空白組（P<0.05），GSH-Px活性雖低于空白組，MDA含量雖高于空白組，但沒有統計學差異（P>0.05）。中劑量復配物組血清CAT活性（7.41±4.51）U/mL顯著高于模型組（3.73±0.34）U/mL（P<0.05），高劑量復配物組血清 SOD（484.02±56.58）活性顯著高于模型組（401.18±24.95）（P<0.05）。與模型組相比，非諾貝特組CAT活性顯著增強，MDA含量顯著降低（P<0.05），但其GSH-Px活性卻遠遠低于空白組（P<0.01）。

2.5.3 腦抗氧化能力分析

黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠腦組織抗氧化能力的影響見表8。

表8 黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠腦組織抗氧化能力的影響Table 8 Effects of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on antioxidant capacity of brain tissue in rats

如表8所示，模型組大鼠腦組織MDA含量顯著高于空白組（P＜0.05），GSH-Px活性顯著低于對照組（P<0.05），CAT活性和SOD活性雖低于空白組，但沒有統計學差異（P>0.05）。中劑量復配物組GSH-Px活性（24.28±5.25）顯著高于模型組（17.77±1.32）U/mg，高劑量復配物組MDA含量（0.75±0.14）nmol/mg顯著低于模型組（1.10±0.14）nmol/mg（P<0.05）。

2.6 黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮復配物對大鼠肝損傷的影響

黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠血清中ALT、AST活力的影響見表9。

表9 黑木耳銀耳山楂提取物對大鼠血清中ALT、AST活力的影響Table 9 Effect of extract of Auricularia auricula,Tremella fuciformis,hawthorn on serum ALT and AST activity in rats

由表9可知，與空白組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST酶活力均顯著性升高（P<0.05）。經過給予藥物干預后，辛伐他汀陽性藥物組、低中高劑量復配物組大鼠血清中的AST、ALT酶活力均顯著下降（P<0.05或P<0.01），而銀耳多糖組、山楂黃酮組這兩個單劑量組大鼠的兩項相應指標均未產生顯著性差異（P>0.05），說明黑木耳銀耳山楂提取物聯合使用對肝臟有保護作用。

2.7 大鼠肝臟的病理變化

大鼠肝臟組織形態學分析見圖1。

光鏡檢查發現：空白組肝臟組織結構清晰，肝細胞索狀排列，肝竇無明顯擴張或狹窄，肝細胞核居中，胞漿豐富，胞膜清晰，肝細胞內未見脂肪空泡細胞核位于細胞中央；模型組肝竇明顯狹窄，肝索排列較紊亂，部分肝細胞中出現大小不等的脂肪空泡核固縮。給藥后肝組織結構較模型組變清晰，辛伐他汀、非諾貝特組以及各單劑量組、低劑量復配組肝索排列較空白組紊亂，以中高劑量復配物組干預效果最為明顯。

圖1 大鼠肝臟組織形態學分析（HE染色，×400）Fig.1 Histomorphological analysis of rat liver（HE staining，×400）

3 討論

高血脂癥即為血脂紊亂或血脂異常，是指人體內血清脂質的濃度超出了正常范圍，包括血清總膽固醇（TC）水平升高、血清甘油三酯（TG）水平升高、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低等，是心腦血管疾病的主要危險因素之一。本實驗以Wistar雄性大鼠為研究對象，采用高脂飼料喂養法建立高脂模型，具有飼養方便、抵抗力強，食性與人相近等優點[18]。

實驗結果表明，模型組與空白組相比較，體重增量、TC、TG、LDL均顯著升高，HDL-C顯著降低，表明本實驗高脂血癥模型建立成功。根據醫學研究表明，血清中TC、TG、LDL-C含量的升高和HDL-C含量的降低更容易誘發動脈粥樣硬化和心腦血管疾病[19]。HDL-C是將肝臟組織外的膽固醇逆向轉運回肝臟的主要形式，而LDL-C是將肝臟合成的膽固醇轉運到全身組織的主要形式。通過對試驗數據分析得到，只有高劑量組高密度脂蛋白與模型組形成顯著性差異，推測高劑量組可能是提高HDL-C的含量，從而降低血清中TC、TG、LDL-C水平，達到降低血脂的目的。這與單科開等[20]對苦菜黃酮降血脂功能的研究中出現的結果相似。

肝臟損傷與其代謝異常密切相關，其中脂質代謝紊亂是肝臟損傷的一個重要因素。ALT主要分布在肝細胞漿，AST主要分布在肝細胞漿和肝細胞的線粒體中。肝細胞壞死時ALT和AST就會升高[21]。根據數據分析得到，與模型組比較，辛伐他汀組、低中高劑量復配物組大鼠血清中的AST、ALT酶活力均顯著下降（P<0.05或P<0.01），而銀耳多糖組、山楂黃酮組這兩個單劑量組大鼠的兩項相應指標均未產生顯著性差異（P>0.05）。說明黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮聯合作用對肝臟有保護作用。

肝臟系數能反應肝臟的損傷程度，肝臟系數增大說明肝臟組織發生增生肥大或水腫等。結合肝組織形態學觀察結果發現，過多的油脂攝入使脂肪積累，造成肝臟負擔加重或病變，肝臟質量增加，從而使肝臟系數增加。本實驗中各實驗組肝臟系數均較空白組高，與模型組相比，辛伐他汀組及各單劑量組、低中高劑量復配物組的肝臟系數均有降低，且高劑量復配物組差異有統計學意義（P<0.05），說明高劑量組能夠改善肝臟組織。通過動物肝臟細胞病理切片可知，中高劑量復配物組能有效地減少脂肪空泡，肝索細胞排列較整齊，改善肝臟組織，對高血脂癥具有一定的治療效果，在一定程度上能減輕病變。

在食用高脂食物過程中，會造成機體血脂異常，血脂異常會導致機體抗氧化能力下降，氧自由基生成增加，脂質過氧化作用增強[22]。SOD、GSH-Px和CAT是體內重要的三大酶類抗氧化劑，SOD能使超氧自由基歧化為過氧化氫和氧，CAT可使過氧化氫分解成為水和氧，GSH-Px可催化還原型的谷胱甘肽轉變為氧化型的谷胱甘肽，從而消除細胞中的有機或無機的過氧化物。丙二醛（MDA）是脂質過氧化反應鏈終止階段產生的小分子產物，對細胞膜有嚴重的破環作用，機體中MDA的水平可以間接反映機體組織細胞的過氧化程度[23]。本實驗結果表明，低中高劑量復配物組能不同程度抑制血清、腦和肝臟組織中SOD和GSH-Px，使之活力下降，其量效關系均呈正相關，提示黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮聯合作用可通過增強體內抗氧化系統發揮抗氧化作用。

4 結論

黑木耳多糖、銀耳多糖、山楂黃酮提取物聯合使用能降低因高脂血癥引發的大鼠的血脂水平，同時還能改善大鼠的肝臟損傷，降低高脂血癥對體內脂質過氧化產物的含量，提高機體的抗氧化能力，這對于預防高脂血癥的發生有重要的作用，此外也為黑木耳銀耳山楂藥食同源的高附加值產品的利用奠定理論基礎。