產(chǎn)正丁醇脫氫酶微生物的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

郝媛，王東，特日格樂，楊德志，郭昊翔，陳忠軍，孫子羽，滿都拉*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古農(nóng)牧漁業(yè)生物實(shí)驗(yàn)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)新蒙醫(yī)藥工程研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

高級(jí)醇（higher alcohols）是酒精飲料中重要的香氣成分之一，它除本身呈香外，還能與酸類結(jié)合形成酯，使酒精飲料具有獨(dú)特的風(fēng)味[1]。當(dāng)酒中高級(jí)醇含量過高時(shí)，不僅會(huì)導(dǎo)致辛辣苦澀，也是飲用后造成頭痛的原因之一[2-4]。因此，高級(jí)醇的含量必須控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。目前，在傳統(tǒng)酒類釀造過程中主要通過調(diào)控發(fā)酵溫度[5]、微生物種類[6-7]、原輔料比[8]、添加糖化酶和蛋白酶[9-10]、蒸餾以及后陳化[11-12]等方式調(diào)控酒中高級(jí)醇的含量和種類。但由于傳統(tǒng)酒類的釀造過程中涉及眾多微生物的共同參與，工藝復(fù)雜，有關(guān)高級(jí)醇合成的機(jī)制尚未完全揭示，導(dǎo)致有關(guān)傳統(tǒng)酒類發(fā)酵過程中高級(jí)醇的調(diào)控一直以經(jīng)驗(yàn)式為主。

研究顯示，乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenases，ADHs）在輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）參與條件下能夠?qū)⒋嫁D(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛，這類酶在酵母及原核生物中廣泛存在[13-15]，至少有25個(gè)EC編號(hào)的酶被稱為醇脫氫酶[16]。酒精飲料可被視為一種以各種水溶性和非水溶性風(fēng)味物質(zhì)為溶質(zhì)，以水和乙醇組成的混合體系為溶劑的非水相體系。在非水相體系中，醇脫氫酶以NAD+為輔酶依然能夠完成醇的轉(zhuǎn)化[17-19]。相關(guān)研究也證實(shí)從蘋果皮渣中提取的酶能使白酒中高級(jí)醇含量降低[20-21]。在非水相體系中影響醇脫氫酶活性的因素除有機(jī)相本身的性質(zhì)以外，底物性質(zhì)、輔助因子濃度、水含量、初始pH值和溫度等都對(duì)酶催化有重要影響[22-24]。

本文以正丁醇（n-butanol）為研究對(duì)象，擬通過分離篩選獲得能夠在乙醇存在條件下催化正丁醇的微生物，并研究影響其催化活性的因素，為進(jìn)一步研究混合發(fā)酵過程中正丁醇的合成及建立調(diào)控酒類發(fā)酵過程中正丁醇含量的方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌從酒曲及發(fā)酵酒醅（北方某濃香型白酒企業(yè)）中分離獲得。正丁醇、無水乙醇：天津永晟精細(xì)化工有限公司；NAD+輔酶（純度>98%）：北京酷來博科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉：天津化學(xué)試劑三廠；瓊脂、瓊脂糖：US EVERBRIGHT。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；Synergy H1全功能微孔板檢測(cè)儀：美國伯騰儀器有限公司；PerkinElmer Clarus680氣相色譜儀、TurboMatrix 40 Trap頂空進(jìn)樣器：珀金埃爾默有限公司；DYCP-31BN型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 培養(yǎng)基

溶菌肉湯培養(yǎng)基（lysozyme nutrient broth base，LB）：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g、水1 L調(diào)pH值至 7.0后，121℃滅菌15 min。結(jié)合緩沖液（binding buffer）（mmol/L）：NaH2PO450 mol/L、NaCl 300 mol/L、咪唑10 mol/L，用NaOH調(diào)至pH 8.0；NAD+溶液：稱取0.066 34 g NAD+，加10 mL超純水，現(xiàn)配現(xiàn)用。正丁醇反應(yīng)底物：100 mL水中加入0.3%正丁醇、3%乙醇；50×TAE緩沖液：24.2% Tris、5.71%冰醋酸、3.72%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）；1×TAE緩沖液：稀釋50×TAE緩沖液。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)正丁醇脫氫酶微生物的分離

取酒曲或酒醅1.0 g溶于無菌水中，振蕩混勻后通過稀釋涂布（LB培養(yǎng)基），分離純種微生物。待稀釋涂布培養(yǎng)基上長出菌落后，用接菌環(huán)分別挑取每個(gè)平板上所有形態(tài)及顏色不同的單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，并對(duì)菌落進(jìn)行記錄和編號(hào)，重復(fù)3次，直到獲得單菌落為止。將獲得的純種微生物斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 粗酶液的制備

經(jīng)液體LB培養(yǎng)后的微生物離心，棄上清，收集菌體。收集到的菌體用結(jié)合緩沖液清洗3次后，加入結(jié)合緩沖液重懸并混勻。重懸后的菌液在150 W、30 min、工作10 s、間歇15 s冰浴的條件下超聲破碎。破碎后在10 000 r/min、30 min、4℃的條件下離心，取上清為粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 相對(duì)酶活力的檢測(cè)

吸光值法：利用酶標(biāo)儀在340 nm下測(cè)定反應(yīng)體系10 min內(nèi)吸光值變化，以吸光值的變化反映酶活大小[25]。頂空氣相色譜法：以轉(zhuǎn)化產(chǎn)物或底物的變化量指示酶活力。具體條件為：頂空恒定時(shí)間進(jìn)樣，載氣、色譜柱壓力 0.172 MPa（25psi）。溫度：取樣針 100 ℃、傳輸線100℃、爐溫70℃。進(jìn)樣0.01 min、加壓2 min、拔針0.1min、保溫30min、氣相色譜分析循環(huán)35min。氣化室：溫度250℃、分流條件1∶100。氣體：載氣N21 mL/min、補(bǔ)償氣30 mL/min、氫氣45 mL/min、空氣 450 mL/min。色譜柱：DB-wax 30 m×0.32 mm×0.25 μm，溫度程序：起始40℃（5 min）、升溫速率5℃/min、一階溫度100℃、升溫速率10℃/min、二階溫度180℃（5 min）。檢測(cè)器：FID、溫度250℃、信號(hào)衰減-6。

1.4.4 產(chǎn)正丁醇脫氫酶微生物篩選

以粗酶液、NAD+溶液和底物混合組為處理組，以NAD+和酶液以及單獨(dú)底物溶液為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行。篩選方法：將篩得的菌株分別進(jìn)行酶活檢測(cè)，反應(yīng)體系為酶液 25 μL、NAD+溶液 25 μL、底物 150 μL，設(shè)定3組平行?；靹蚝笥妹笜?biāo)儀測(cè)定酶反應(yīng)液第1分鐘到第10分鐘內(nèi)在30℃下的OD340。

1.4.5 產(chǎn)正丁醇脫氫酶微生物的鑒定及生長曲線

以產(chǎn)酶菌株的基因組DNA為模板，采用16S rRNA基因通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3′）和 1492r（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3′）擴(kuò)增16S rRNA基因。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系：2×Taq PCRMastermix 25 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 2 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR 條件為：第一階段，94.0 ℃持續(xù)10.0 min。第二階段，95.0℃持續(xù)0.5 s后55.0℃持續(xù)0.5 s，再在72.0℃持續(xù)1.5 min。第二階段循環(huán)30次。第三階段，72.0℃持續(xù)10 min后16.0℃持續(xù)2 min。PCR完成后，將PCR產(chǎn)物按順序加入瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，電壓為120 V，電泳時(shí)間30 min。完成后置于凝膠成像儀下觀察條帶，根據(jù)Marker確定片段長度。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。生長曲線繪制：將菌種接種到300 mL液體LB培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取試管，每管加入8 mL LB液體培養(yǎng)基，分別接入200 μL菌液，30℃、300 r/min 振蕩培養(yǎng)。分別測(cè)定 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26 h 在 600 nm 波長處的 OD值。根據(jù)3次重復(fù)測(cè)定所得的數(shù)據(jù)求出平均值，以O(shè)D600做縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間做橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.4.6 影響酶活力的因素

培養(yǎng)基對(duì)酶活力的影響：取培養(yǎng)后的菌株，在分別加入3%乙醇、0.3%丁醇以及200 mL液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，在1.4.2的相同條件下提取粗酶液，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制不同體系，用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液第1分鐘到第10分鐘內(nèi)在30℃下的OD340。

溫度對(duì)酶活力的影響：將得到的粗酶液在20、25、30、35、40、45、50 ℃分別與底物反應(yīng) 3 min，30 ℃下測(cè)定OD340吸光度的變化，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)平行。

pH值對(duì)酶活力的影響：分別配制不同 pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的底物，通過氣相色譜儀檢測(cè)不同pH值對(duì)丁醇轉(zhuǎn)化的影響。

金屬離子對(duì)酶活力的影響：在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為 1 mmol/L的不同金屬離子（Fe2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+），充分反應(yīng)后，通過氣相色譜儀檢測(cè)不同pH值對(duì)正丁醇轉(zhuǎn)化的影響。

乙醇濃度對(duì)酶活力的影響：將反應(yīng)底物中的乙醇含量調(diào)節(jié)為0%、5%、10%、15%、20%、25%，使用氣相色譜檢測(cè)丁醇、乙醇的含量。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析及繪圖

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)正丁醇脫氫酶微生物篩選

從酒曲及酒醅中共分離出71株微生物，通過粗酶提取和酶活檢測(cè)后，從中初步選出6株具有催化能力的菌株，分別為 DQ-54、DQ-43、DQ-32、PP-31、DQF-10和JN-4。

產(chǎn)正丁醇脫氫酶微生物的篩選及驗(yàn)證見圖1。

菌株DQ-54和PP-31吸光值變化較大 （結(jié)果如圖1A所示），但PP-31菌株生長緩慢，因此進(jìn)一步研究選取菌株DQ-54進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。為了進(jìn)一步確定所篩微生物具有丁醇脫氫活性，分別設(shè)置4種對(duì)照（酶對(duì)照組、乙醇對(duì)照組、底物對(duì)照組和乙醇加酶對(duì)照組）研究該酶的催化活力。結(jié)果顯示，處理組的吸光值顯著的高于其他4組，說明所篩酶具有醇脫氫能力，且在相同乙醇濃度（3%）下添加正丁醇（0.3%）能夠顯著影響吸光值的變化，說明該酶可能具有丁醇催化能力（結(jié)果如圖1B所示）。為進(jìn)一步確定所篩酶具有丁醇催化能力，利用頂空-氣相色譜技術(shù)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，菌株DQ-54的粗酶液能夠在乙醇存在的條件下（乙醇含量為1%）催化體系中的正丁醇（濃度為0.3%）。另外，從試驗(yàn)結(jié)果來看，該酶能夠顯著的降低乙醇和正丁醇的含量（P＜0.05），并將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的乙醛和丁醛（如圖1C所示）。

圖1 產(chǎn)正丁醇脫氫酶微生物的篩選及驗(yàn)證Fig.1 Screening and validation of n-butanol-dehydrogenaseproducing microorganism

2.2 菌株DQ-54的鑒定及其生長規(guī)律

菌株DQ-54的系統(tǒng)發(fā)育樹和生長曲線見圖2。

圖2 菌株DQ-54的系統(tǒng)發(fā)育樹和生長曲線Fig.2 Phylogenetic tree and growth curve of DQ-54

以菌株DQ-54細(xì)胞破碎液為模板，利用通用引物（27f和1492r）擴(kuò)展所篩微生物的16S rRNA，經(jīng)測(cè)序后構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（N-J法）如圖2A所示。從結(jié)果來看，所篩菌株DQ-54的16S rRNA片段與腸桿菌屬（Enterobacter）微生物相似性較高（相似度99%），將菌株DQ-54初步鑒定為生癌腸桿菌（Enterobacter cancerogenus），還需進(jìn)一步結(jié)合理化性質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)，這里將DQ-54產(chǎn)生的醇脫氫酶命名為Ec-54ADH。以LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株DQ-54，每2 h取樣后測(cè)定OD600值構(gòu)建的生長曲線如圖2B所示。菌株DQ-54的OD值在0～2 h時(shí)上升緩慢，2 h～8 h時(shí)，極速上升，為對(duì)數(shù)生長期，因此收集菌體應(yīng)在8 h以后。12 h后菌體保持平穩(wěn)狀態(tài)，26 h后進(jìn)入衰亡期。

2.3 影響酶催化活力因素的研究

2.3.1 乙醇濃度對(duì)Ec-54ADH催化正丁醇的影響

通過考察Ec-54ADH在不同濃度乙醇（0%～25%）下對(duì)正丁醇（0.3%）的催化活力，研究乙醇對(duì)Ec-54ADH催化丁醇活力的影響，結(jié)果如圖3所示。

合同管理是建筑企業(yè)管理的重要內(nèi)容，也是降低工程成本，提高經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑。工期合同的進(jìn)度要求是可以直接影響到工程施工質(zhì)量的，但是在正常時(shí)空中，并不是能一切都能按照原計(jì)劃進(jìn)行，眾所周知，工期如果出現(xiàn)變動(dòng)會(huì)提高施工成本問題，所以，管理人員要對(duì)合同要求有全面的了解。在施工之前，管理人員和工程設(shè)計(jì)方案部門進(jìn)行好對(duì)接，并且制定出良好的施工流程[3]。

隨著乙醇濃度的增加，Ec-54ADH對(duì)正丁醇和乙醇的催化活力都逐漸減弱，但在乙醇濃度為25%時(shí)Ec-54ADH依然表現(xiàn)出了對(duì)乙醇的催化活力（乙醛濃度為65.552 mg/L），而對(duì)于正丁醇已經(jīng)喪失了催化活力。當(dāng)體系中不存在乙醇時(shí)Ec-54ADH對(duì)正丁醇具有最高的催化活力，在乙醇濃度為5%～20%之間時(shí)Ec-54ADH依然具有催化正丁醇的活力。這些結(jié)果顯示，乙醇濃度增加使Ec-54ADH對(duì)正丁醇催化特異性有很大的影響。隨著乙醇濃度的增加，Ec-54ADH依然具備醇脫氫能力，催化乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，但對(duì)正丁醇轉(zhuǎn)化能力逐漸降低，直至喪失（25%乙醇）。

圖3 乙醇濃度對(duì)Ec-54ADH催化的影響Fig.3 The effect of ethanol on the activity of Ec-54 ADH

2.3.2 溫度及添加乙醇培養(yǎng)對(duì)Ec-54ADH催化活力的影響

溫度和培養(yǎng)基中添加乙醇對(duì)Ec-54ADH催化活力的影響見圖4。

通過設(shè)置不同溫度（25℃～50℃）考察Ec-54ADH在不同溫度下催化丁醇的活力，結(jié)果顯示（圖4A），Ec-54ADH的催化活力隨著溫度升高先升高后降低，最適溫度為40℃（p<0.05），所設(shè)置的溫度中，25℃時(shí)酶活力最差。添加3%乙醇為處理組，添加等體積蒸餾水為對(duì)照組來考察在培養(yǎng)過程中添加乙醇對(duì)菌株DQ-54產(chǎn)醇脫氫酶的影響，結(jié)果如圖4B顯示，添加乙醇培養(yǎng)的菌株DQ-54的Ec-54ADH催化活力與對(duì)照相比顯著降低（p<0.05）。為進(jìn)一步研究培養(yǎng)基添加乙醇對(duì)DQ-54生長的影響，設(shè)置不同濃度乙醇培養(yǎng)（0%～15%）后發(fā)現(xiàn)（圖4C），添加3%的乙醇能夠顯著抑制DQ-54的生長（p<0.05），添加量大于6%時(shí)DQ-54基本停止生長。

圖4 溫度和培養(yǎng)基中添加乙醇對(duì)Ec-54ADH催化活力的影響Fig.4 Effect of ethanol added in medium and temperature on catalytic activity of Ec-54ADH

2.3.3 pH值和金屬離子對(duì)Ec-54ADH催化活力的影響

pH值和金屬離子對(duì)Ec-54ADH催化活力的影響見圖5。

pH值通過影響酶和底物的帶電特性來影響酶的活性中心與底物的結(jié)合能力，從而影響酶的催化活性。適宜的pH值能夠促進(jìn)底物與酶的結(jié)合，有利于酶的催化作用。從試驗(yàn)結(jié)果來看，Ec-54ADH催化正丁醇的最適pH值為7，當(dāng)pH值大于8時(shí)，酶的活力顯著降低（圖5A）。5種金屬離子對(duì)正丁醇的轉(zhuǎn)化均無促進(jìn)作用，添加金屬離子后正丁醇含量均顯著高于對(duì)照組，丁醛含量顯著低于對(duì)照組（圖5B）。結(jié)果表明，F(xiàn)e2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+對(duì)丁醇轉(zhuǎn)化均有抑制作用，而 Cu2+幾乎完全抑制酶的活力。

圖5 pH值和金屬離子對(duì)Ec-54ADH催化活力的影響Fig.5 Effect of pH and metal ions on catalytic activity of Ec-54ADH

3 討論

醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）是生物體內(nèi)重要的氧化還原催化劑之一，在生物催化、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用[26]。在生物催化領(lǐng)域，已有采用3種脫氫酶催化二氧化碳轉(zhuǎn)化甲醇，從而開辟二氧化碳應(yīng)用新途徑的報(bào)道[27]。醇脫氫酶在胞內(nèi)代謝中具有重要的生理意義，可催化醇的氧化或酮、醛的還原。有研究表明，正丁醇可通過氧化反應(yīng)生成正丁醛，醇氧化為醛的機(jī)理：ROH+[O]→RCHO+H2O[28-29]。利用蘋果中的醇降解酶降解正己醇的報(bào)道顯示，添加來源于蘋果的醇脫氫酶能夠顯著降低白酒中的正己醇[21，30-31]。將地霉屬（Geotrichum）菌株添加到葡萄酒和白酒中，通過氣質(zhì)聯(lián)用發(fā)現(xiàn)，酒樣中高級(jí)醇含量均有下降。其中，1-丁醇轉(zhuǎn)化為丁酸丁酯，3-甲基-1-丁醇（異戊醇）轉(zhuǎn)化為3-甲基丁酸[32]。本研究中，通過分離純化得到一株腸桿菌屬（Enterobacter）細(xì)菌，具有能夠在乙醇存在條件下（5%）催化正丁醇轉(zhuǎn)化為正丁醛的能力。腸桿菌屬微生物是白酒釀造過程中常見微生物[33]。因此可以推論，在傳統(tǒng)酒釀造過程中，正丁醇的產(chǎn)生與進(jìn)一步代謝不僅與釀酒酵母關(guān)系密切[2]，與腸桿菌屬細(xì)菌可能也具有一定的關(guān)系，腸桿菌屬微生物在丁醇的產(chǎn)生過程中起到一定的作用。經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，Enterobacter cancerogenus CR-Eb1（CP025225.1）基 因組中共有8個(gè)基因注釋為具有醇脫氫酶活性。本研究中的粗酶液可能是這些酶的混合物，需進(jìn)一步深入研究。從試驗(yàn)結(jié)果來看（圖3），隨著乙醇濃度的增加（0%～25%），Ec-54ADH對(duì)正丁醇的催化能力逐漸減弱，但是依然具有乙醇脫氫的能力。這個(gè)結(jié)果在一定程度上可以解釋，在酒類發(fā)酵過程中高級(jí)醇積累與乙醇濃度相關(guān)的原因。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，體系中乙醇的濃度逐漸增加，使原本能夠催化高級(jí)醇的酶的特異性改變，對(duì)高級(jí)醇的催化能力減弱。相關(guān)研究也證實(shí)高級(jí)醇是與乙醇偶聯(lián)產(chǎn)生的，在發(fā)酵后期逐漸積累[34]。

酒可視為一種由乙醇和水組成的非水相體系。其中的風(fēng)味物質(zhì)是該體系中的溶質(zhì)。乙醇屬于親水性溶劑，Zaks等發(fā)現(xiàn)酶的活性在疏水性溶劑中比在親水性溶劑中更高[35]。由Narayan等報(bào)道可知，重要的是疏水性，而不是極性或與水的混溶性[36]。如果底物更易溶于溶劑，則底物分子將難以被酶利用，溶劑介質(zhì)的性質(zhì)會(huì)影響酶的對(duì)映選擇性和區(qū)域選擇性[37]。本研究中，高濃度乙醇下Ec-54ADH對(duì)正丁醇的催化能力逐漸減弱可能因?yàn)橐掖加绊懥薊c-54ADH的選擇性，乙醇濃度增加使正丁醇更難與酶接觸。因?yàn)檎〈嫉氖杷愿哂谝掖?，而高濃度的乙醇能夠使正丁醇溶解在體系中，不能靠近酶。

在傳統(tǒng)白酒釀造過程中，水質(zhì)對(duì)白酒的品質(zhì)影響較大。水中的金屬離子能夠影響微生物的生長和酶催化活性。金屬離子在生物體內(nèi)發(fā)揮著多種功能，部分金屬離子轉(zhuǎn)移到特定部位成為金屬酶的活性中心或生物大分子的結(jié)構(gòu)組成部分對(duì)其在體內(nèi)的平衡也起到一定作用[38-40]。研究顯示，F(xiàn)e2+和Zn2+對(duì)醇脫氫酶有重要作用[41]。本研究中，模擬自然發(fā)酵狀態(tài)下（乙醇濃度為 3.00%），額外添加金屬離子（Fe2+、Mg2+、Mn2+、Zn2和Cu2+）對(duì)正丁醇轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果顯示，額外添加一定濃度的金屬離子（1 mmol/L）均能夠影響Ec-54ADH對(duì)正丁醇的催化能力，使其催化能力下降。其中，Cu2+能夠顯著抑制Ec-54ADH的催化活力。因此，在酒類發(fā)酵過程中金屬離子的種類對(duì)高級(jí)醇的合成與代謝有一定的影響。

本研究的目的是篩選出一株能夠在乙醇存在條件下轉(zhuǎn)化正丁醇的酶。結(jié)果顯示，雖然所篩Ec-54ADH能夠在乙醇存在條件下轉(zhuǎn)化正丁醇，但隨著乙醇濃度的增加對(duì)正丁醇的催化能力逐漸減弱。這就需要在后期對(duì)酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椗c改造，以提高其應(yīng)用能力[42-43]。對(duì)于醇脫氫酶的應(yīng)用來說，輔酶再生是實(shí)現(xiàn)氧化還原酶催化反應(yīng)的必須步驟，是關(guān)系到氧化還原酶工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵[44]。

4 結(jié)論

本研究經(jīng)過篩選和驗(yàn)證得到了一株能夠產(chǎn)生丁醇脫氫酶的微生物。該微生物所產(chǎn)的丁醇脫氫酶能夠在乙醇存在條件下催化正丁醇，乙醇含量為5.00%時(shí)依然具有催化正丁醇的能力，但隨著乙醇濃度的增加，該酶對(duì)正丁醇的催化能力逐漸減弱。在乙醇存在條件下，該酶的最適催化溫度為40℃、最適pH值為7，額外添加金屬離子能夠降低該酶催化正丁醇的能力。這為進(jìn)一步開發(fā)利用該酶及建立調(diào)控成品酒類生產(chǎn)中正丁醇含量方法奠定基礎(chǔ)。