丙泊酚通過調控miR-574-5p/SOX2表達抑制胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移

汪琪云 尹利 陳英

(重慶市江津區中心醫院麻醉科，重慶 402260)

胃癌5年總生存率低于30%，是一個相當大的健康負擔[1-2]。目前，外科手術仍然是臨床治療胃癌的重要手段，而圍術期過程中所用到的麻醉藥與術后腫瘤復發和轉移存在著復雜關聯[3]。丙泊酚是一種常用的靜脈注射麻醉藥，不僅具有誘導或維持全身麻醉的作用，還有著潛在的抗腫瘤作用[4-5]。有研究[6-7]指出，丙泊酚可通過抑制細胞增殖、侵襲和遷移抑制胃癌惡性進展，但具體的機制并不完全明確。越來越多的研究[8-9]顯示，丙泊酚的抗腫瘤作用與其調控的微小RNA(microRNA，miRNAs)有著密切關系。miR-547-5p是miRNAs家族成員，被證實在胃癌組織中異常高表達，與腫瘤大小、分期和遠處轉移密切相關[10]。同時，有研究[11]指出，丙泊酚可通過下調神經元中miR-547-5p的表達發揮治療作用。然而丙泊酚能否通過調控miR-547-5p表達影響胃癌細胞的生物學行為尚未可知。為此，本研究通過體外細胞實驗探討丙泊酚抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人胃癌細胞株AGS(中科院上海細胞庫)；胎牛血清、洛斯維公園紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)-1640培養基和胰蛋白酶(美國Gibco)；青霉素、鏈霉素和引物(上海生工生物工程)；LipofectamineTM2000和cDNA逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen)；性別決定區Y框蛋白2(Sex-determining region of Y chromosome-related high-mobility-group box 2，SOX2)抗體和β肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Abcam)；辣根過氧化酶標記的二抗(北京中杉金橋)；miR-574-5p模擬物和陰性對照、SOX2小干擾RNA及其對照、SOX2過表達質粒及空載體質粒(廣州銳博生物)；細胞計數(Cell Counting Kit-8，CCK-8)試劑盒(北京索萊寶)；雙熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega)；Trizol試劑、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、全功能多波長酶標儀和二氧化碳細胞培養箱(美國Thermo Fisher)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)儀(美國ABI)；Transwell小室(美國Corning)；倒置顯微鏡和紫外可見分光光度計(上海譜元儀器)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 AGS細胞培養 采用含10 mg/mL鏈霉素、10 kU/mL青霉素和100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養基在條件為溫度37 ℃、濕度飽和、50 mL/L二氧化碳的細胞培養箱中常規AGS細胞。待細胞密度達80%左右時，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，并以1:2比例傳代。實驗所用細胞為生長良好的第3～5代對數生長期細胞。

1.2.2 AGS細胞轉染 將對數生長期的AGS細胞按照每孔106個接種至6孔細胞板上，分別加入不同濃度(0、5、10、20 μg/mL)的丙泊酚處理48 h，依次記為0 μg/mL組、5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組，按照下述實驗步驟檢測細胞存活率、克隆形成率、遷移和侵襲細胞數、miR-574-5p和SOX2表達水平，確定丙泊酚使用濃度。將AGS細胞接種6孔細胞板，待細胞匯合度達70%以上時，參照LipofectamineTM2000說明書步驟將miR-NC、miR-574-5p模擬物、si-con、si-SOX2、miR-574-5p模擬物+pcDNA、miR-574-5p模擬物和pcDNA-SOX2分別轉染AGS細胞，轉染48 h后給予20 μg/mL丙泊酚處理24 h，依次標記為丙泊酚+miR-NC組、丙泊酚+miR-574-5p組、丙泊酚+si-con組、丙泊酚+si-SOX2組、丙泊酚+miR-574-5p+pcDNA組和丙泊酚+miR-574-5p+pcDNA-SOX2組，同時設置對照組(未處理)、丙泊酚組(加入20 μg/mL丙泊酚處理48 h)。其中每組設置3個復孔。給藥結束后，收集各組細胞，按照下述實驗步驟檢測miR-574-5p和SOX2蛋白表達、細胞存活率、克隆形成率、遷移和侵襲細胞數。

1.2.3 CCK-8法檢測AGS細胞增殖 將各組AGS細胞以每孔1×104個接種至96孔板上后，置于細胞培養箱中常規培養。其中每個處理設置3個復孔。同時以無細胞的培養液作為空白調零組。每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育4 h后，上酶標儀檢測細胞在490 nm波長處的吸光度值，并按照(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%公式計算各組細胞的存活率。實驗重復3次。

1.2.4 平板克隆形成實驗檢測AGS細胞克隆形成能力 收集各組AGS細胞，吹打制成單細胞懸液；以含血清培養基進行梯度稀釋，分別以50、100和200個細胞梯度接種至10 mL的培養皿中，置于細胞培養箱中培養14～21 d；待出現肉眼可見集落時，終止培養。棄培養液，以磷酸緩沖液洗滌細胞2次。以4%多聚甲醛固定20 min后，0.1%結晶紫染色15 min。洗去染色液，空氣干燥后，采用顯微鏡觀察各組細胞的克隆形成情況，其中以大于10個細胞的集落作為一個有效克隆，以克隆數與接種細胞數的百分比表示各組細胞的克隆形成率。實驗重復3次。

1.2.5 Transwell小室檢測AGS細胞侵襲與遷移 ①侵襲實驗：在實驗前，將基質膠按照1∶3比例以無血清培養基稀釋后，取50 μL平鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜表面上，室溫下充分融合。收集各組AGS細胞，制備濃度為105個/mL的細胞懸液。將基質膠包被后的Transwell小室放入24孔細胞板上，其中小室下室中加有600 μL含血清培養基，在小室上室內加入200 μL細胞懸液。放入細胞培養箱中常規培養24 h后，將小室小心取出，以棉簽輕輕拭去未穿膜的細胞后，分別以4%多聚甲醛和0.1%結晶紫對細胞進行固定與染色。洗去染色液后，采用顯微鏡觀察統計隨機選取的3個視野內的穿膜細胞數目，結果取均值。實驗重復3次。②遷移實驗：實驗步驟與侵襲實驗基本相同，只是不需要對Transwell小室聚碳酸酯膜進行包被。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測AGS細胞中miR-574-5p的表達 采用Trizol法提取AGS細胞總RNA后，采用紫外分光光度計檢測RNA的濃度。將高質量的RNA參照cDNA逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA后，以cDNA作為模板上PCR儀進行擴增。以U6為內參，采用2-△△Ct法計算AGS細胞中miR-574-5p的表達水平。實驗重復3次。其中，PCR引物序列如下：miR-574-5p上游：5′-GGGGTGAGTGTGTGT GTG-3′，下游：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6 上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應參數：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，循環40次；72 ℃總延伸5 min。

1.2.7 免疫印跡法檢測AGS細胞中SOX2蛋白的表達 采用放射免疫沉淀法提取AGS細胞總蛋白后，參照BCA檢測試劑盒說明書檢測總蛋白的濃度與純度。將熱變性后的蛋白樣品按照每孔80 μg上樣至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠孔中行電泳分離。電泳結束后，電轉至聚偏二氟乙烯上。5%脫脂奶粉封膜2 h后，加入按照1∶1 000比例稀釋的SOX2和β-actin抗體室溫孵育2 h；再以按照1∶2 000比例稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1.5 h。經化學發光劑顯影曝光后，以β-actin為內參，采用凝膠成像系統掃描分析AGS細胞中SOX2蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-574-5p與SOX2的靶向關系 采用TargetScan生物信息學軟件預測到miR-574-5p與SOX2 3′非翻譯區(Untranslated Region，UTR)存在互補的結合位點。將SOX2 3′UTR片段克隆擴增至熒光素酶載體上，構建SOX2野生型(SOX2-WT)載體；另外，將miR-574-5p與SOX2 3′UTR結合位點定點突變后克隆重組到熒光素酶載體上，作為SOX2突變型(SOX2-MUT)載體。將SOX2-WT、SOX2-MUT載體參照脂質體2000說明書步驟分別與miR-574-5p模擬物及其陰性對照(miR-NC)共轉染至AGS細胞中。轉染48 h后，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測AGS細胞的熒光酶活性。實驗重復3次。

2 結果

2.1 丙泊酚抑制胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移 與0 μg/mL組比較，5、10和20 μg/mL丙泊酚處理組細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數均明顯降低(P<0.05)，且呈濃度依賴性，見表1。

表1 各組細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數的比較Table 1 Comparison of cell survival rate,clone formation rate,invasive cell number and migrating cell number in each group

2.2 丙泊酚下調胃癌AGS細胞中miR-574-5p表達且上調SOX2蛋白表達 與0 μg/mL組比較，5、10和20 μg/mL丙泊酚處理組細胞中miR-574-5p表達水平呈濃度依賴性降低，而SOX2蛋白的表達水平呈濃度依賴性升高(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 免疫印跡法檢測各組細胞中SOX2蛋白表達Figure 1 Detection of Sox2 protein expression in cells of each group by Western blot

表2 各組細胞中miR-574-5p和SOX2蛋白表達水平的比較Table 2 Comparison of mir-574-5p and Sox2 protein expression levels in cells of each group

2.3 SOX2是miR-574-5p的潛在靶基因 miR-574-5p與SOX2 3′UTR存在互補的結合位點；miR-574-5p模擬物與SOX2-WT共轉染后細胞的熒光素酶活性較相應對照miR-NC組明顯降低(P<0.05)；但miR-574-5p模擬物與SOX2-MUT共轉染后細胞的熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、表3。

圖2 miR-574-5p和SOX2 3′UTR存在互補的結合位點Figure 2 Complementary binding sites of mir-574-5p and Sox2 3′UTR

表3 各組細胞熒光素酶活性的比較Table 3 Comparison of luciferase activity in each group

2.4 上調miR-574-5p表達或下調SOX2表達逆轉丙泊酚對胃癌AGS細胞細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與對照組比較，丙泊酚組AGS細胞中miR-574-5p的表達水平明顯降低，而SOX2蛋白的表達水平明顯升高，細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數均明顯降低(均P<0.05)；丙泊酚+miR-NC組AGS中miR-574-5p和SOX2蛋白表達水平、細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數與丙泊酚組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；與丙泊酚組或丙泊酚+miR-NC組比較，丙泊酚+miR-574-5p組AGS細胞中miR-574-5p表達水平明顯升高，SOX2蛋白的表達水平明顯降低，細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數均明顯升高(均P<0.05)。與丙泊酚+si-con組比較，丙泊酚+si-SOX2組AGS細胞中miR-574-5p表達水平明顯升高，SOX2蛋白的表達水平明顯降低，細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數均明顯升高(均P<0.05)，圖3、表4。

表4 各組細胞中miR-574-5p和SOX2蛋白表達水平的比較Table 4 Comparison of mir-574-5p and Sox2 protein expression levels in cells of each group

圖3 免疫印跡法檢測各組細胞中SOX2蛋白的表達Figure 3 Detection of Sox2 protein expression in cells of each group by Western blot

2.5 上調SOX2表達逆轉miR-574-5p對丙泊酚處理的胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移的影響 與丙泊酚+ miR-574-5p+pcDNA組比較，丙泊酚+miR-574-5p+pcDNA-SOX2組AGS細胞SOX2蛋白表達、細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數均明顯升高(均P<0.05)，見圖4、表5。

表5 各組細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數的比較Table 5 Comparison of cell survival rate,clone formation rate,invasive cell number and migrating cell number in each group

圖4 免疫印跡法檢測各組細胞中SOX2蛋白的表達Figure 4 Detection of Sox2 protein expression in cells of each group by Western blot

3 討論

麻醉是手術過程中不可或缺的一部分，作為常用的靜脈注射麻醉藥，丙泊酚在腫瘤手術過程中的作用逐漸引起關注。異丙酚通過抑制解整合素樣金屬蛋白酶8(a disintegrin and metalloprotease domain 8，ADAM8)表達可抑制胰腺癌細胞增殖、遷移，且皮下注射異丙酚可抑制異種移植瘤形成[12]。丙泊酚通過調控miR-133a/性別決定區Y框蛋白4(sex-determining region Y-box 4，SOX4)的表達還可抑制結直腸癌HCT116細胞增殖并促進其凋亡[13]。在乳腺癌中，丙泊酚可通過下調miR-24表達誘導MDA-MB-435細胞凋亡[14]；此外，丙泊酚還在改善乳腺癌改良根治術后復發方面起到了積極作用[15]。目前，已有研究[16]指出丙泊酚具有抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的作用，但具體的作用機制并不完全清楚。

miRNAs是一類內源性非編碼微小RNA，長度在22個核苷酸左右，可通過在轉錄后水平調節靶基因的表達，影響細胞生物學功能，參與包括胃癌在內的多種腫瘤的發生發展[17-18]。miR-574-5p是miRNAs中的重要一員，在甲狀腺乳頭狀癌和宮頸癌等腫瘤中異常高表達，且發揮著重要的促癌作用[19-20]。本研究除發現丙泊酚可抑制胃癌AGS細胞的存活、克隆形成、遷移和侵襲外，還發現丙泊酚可呈濃度依賴性下調AGS細胞中miR-574-5p的表達。這提示miR-574-5p可能在丙泊酚抗胃癌過程中扮演著重要角色。SOX2是性別決定區Y框蛋白基因家族成員，除了參與胚胎發育和性別決定外，其異常表達還與喉癌、大腸癌等腫瘤的發生發展密切相關[21-22]。有研究[23]指出，SOX2在胃癌組織中異常低表達，且在細胞增殖和轉移過程中發揮著重要的抑制作用。本研究發現，丙泊酚作用后胃癌AGS細胞中SOX2蛋白的表達水平呈濃度依賴性升高。這提示，SOX2可能在丙泊酚抗胃癌過程中發揮著重要作用。本研究采用生物信息學軟件預測到miR-574-5p與SOX2 3′UTR區域存在互補的結合位點；同時，雙熒光素酶報告基因實驗證實SOX2是miR-574-5p的潛在靶基因。上調miR-574-5p表達可明顯逆轉丙泊酚對AGS細胞SOX2蛋白表達的促進作用。此外，上調miR-574-5p表達或下調SOX2表達均可逆轉丙泊酚對AGS細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，且過表達SOX2還可逆轉上調miR-574-5p表達對丙泊酚處理的AGS細胞增殖、侵襲和遷移的影響。這提示，丙泊酚可通過下調miR-574-5p表達進而引起其靶基因SOX2表達升高發揮抗胃癌的作用。

4 結論

本研究結果提示，丙泊酚可通過調控miR-574-5p/SOX2表達抑制胃癌AGS細胞增殖、侵襲和遷移，該結果有望為丙泊酚成為胃癌手術治療中的理想麻醉藥提供新的實驗依據。