益肺散結方對肺纖維化大鼠模型自噬及PI3K-AKT-mTOR通路的影響

韓欣 丁曉玲 余濤 包蕊 王馨

(青海省婦幼保健院藥劑科,青海 西寧 810007)

肺纖維化( PF) 是指因肺泡損傷、成纖維細胞增殖、肺泡細胞外基質破壞及過度沉積等多種原因導致的一種肺間質性疾病，可使患者產生呼吸困難、干咳、肺功能通氣障礙、呼吸衰竭等癥狀[1-3]。PF發病率和死亡率逐年升高，嚴重威脅患者生命健康[4-5]。PF發病機制復雜，有研究[6]發現，細胞自噬及上皮細胞間質轉化與PF的發生發展程密切相關。磷脂酰-3激酶(Phosphatidyl-3 kinase，PI3K)/ 蛋白激酶B ( Protein kinase B，Akt)/雷帕霉素靶分子(Rapamycin target molecule，mTOR)信號通路參與調控細胞自噬過程[7]，故調控PI3K/Akt/mTOR信號通路表達，激活肺組織細胞自噬，可緩解PF進程。近來有研究[8-9]發現，益肺散結方對肺癌有較好的療效，且方中黃芪對PF也有一定的治療效果，故本研究推測益肺散結方可能對PF也有較好的療效，并建立大鼠PF模型，探討益肺散結方對大鼠PF過程中PI3K/Akt/mTOR通路和細胞自噬的影響，以期為中藥方劑益肺散結方新療效的開發和臨床合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取清潔級同遺傳背景的SD大鼠50 只，體重 200～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK(粵) 2018-0002，動物質量合格證號為省科委2000A027。所有大鼠于本院動物房中飼養，飼養條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，鼠籠清潔、透氣。本研究經本院動物倫理委員會批準同意，實驗遵循3R原則。

1.2 主要試劑及儀器 益肺散結方組成(黃芪30 g、麥冬15 g、沙參15 g、薏苡仁30 g、杏仁10 g、浙貝母10 g、皂角10 g、莪術15 g、金蕎麥 30 g、白花蛇舌草30 g)常規煎藥，藥液濃縮至生藥含量為5.0 g/mL；博萊霉素(Bleomycin，BLM)購自美國英杰生命技術有限公司(貨號：R250-01)；組織蛋白酶D (cathepsin D,Cat-D)購自美國伯豪生物BD公司(貨號：DXT-610800)；泛素和LC3結合蛋白p62(ubiquitin-andLC3-binding protein p62，p62)抗體購自北京博奧森生物技術有限公司(貨號：bs-2951R-2)；自噬相關蛋白beclin-1抗體購自北京博奧森生物技術有限公司(貨號：bs-1501P)；ɑ-平滑肌動蛋白( ɑ-smooth actin，ɑ-SMA)購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號：YI634-LCE)；微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3，LC3-Ⅱ)/LC3-I 購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：K000467P)；羥脯氨酸elisa試劑盒購自上海聯邁生物工程有限公司(貨號：LM-13650-EB)；HE染色試劑盒購自上海生物公司(貨號：G1120)；馬松(Masson) 染色試劑盒購自愛必信(上海)生物科技有限公司(貨號：abs9347)；p-PI3K/PI3K抗體(貨號：FNAB06243，購自武漢菲恩科技生物有限公司)；Akt抗體(貨號：ab8805，購自美國Abcam)；p-mTOR/mTOR抗體(貨號：ab2732，購自美國Abcam)；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(貨號P0027上海碧云天公司)等。手動輪轉式切片機(型號RM2125RTS，德國Leica公司)；光學顯微鏡(型號SMZ745，日本尼康公司)；酶標儀(型號XElx800，美國Perkin Elmer公司)；蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD，美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號：GIS-500，Miulab公司)等。

1.3 方法

1.3.1 大鼠PF模型建立及分組給藥 參照文獻[9]構建PF模型，具體操作方法為：隨機取40只大鼠，用3%戊巴比妥鈉經腹腔注射麻醉大鼠后，固定大鼠，并用開口器固定口腔，拉出舌頭后，用壓舌板壓住舌腹，行氣管插管并緩慢注入博萊霉素(溶于0.9%的氯化鈉注射液)5 mg/kg，0.3 mL，然后將大鼠直立，沿身體縱軸旋轉3 min即可。將造模成功的大鼠分為PF組、益肺散結方低(7.5 g/kg)、中(15 g/kg)、高(30 g/kg)劑量組，每組10只；另取10只大鼠，除行插管后緩慢注入0.9%的氯化鈉注射液0.3 mL外，其余操作同模型組，將其作為對照組。造模結束后2 h開始給藥，益肺散結方參照文獻[8]以生理鹽水配置為含生藥量0.75、1.50、3.00 g/mL的混懸液，各處理組大鼠均以10 mL/kg的劑量灌胃給藥，對照組與PF組灌胃給予生理鹽水，各組連續給藥21 d，1次/d。

1.3.2 肺組織標本采集 給藥期間觀察大鼠呼吸、毛發、體態及行為活動。于末次給藥24 h后，用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后并處死，解剖大鼠，分別摘取大鼠左右兩肺，經磷酸緩沖鹽沖洗后，左肺置于10%甲醛中固定以備作病理檢查，右肺迅速置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 肺組織HE染色法檢測病理組織形態及炎癥水平 取1.2.2中的左肺，進行常規透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片。將切片進行二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，用蘇木精-伊紅染色 5 min，1%鹽酸酒精分化 10 s，蒸餾水漂洗2 min,梯度酒精脫水2 min，二甲苯透明處理，中性光學樹脂封片后，置于光鏡下觀察分析肺組織結構。隨機選取5個視野，參照文獻[10]用單盲法觀察肺泡炎癥并計分：0分，肺泡透亮、結構清晰、間隔正常；1～2分，肺泡結構稍紊亂、間隔增生增寬，且有少量炎性細胞浸潤，病變范圍占全肺20%；3～5分，肺泡結構紊亂、間隔明顯增寬，炎性細胞浸潤較多，病變范圍占全肺20%～50%；6～8分，肺泡結構紊亂，肺泡融合、間隔顯著增寬，炎性細胞大量浸潤，成纖維細胞增生，膠原纖維大量沉積，病變范圍占全肺20%～50%。每組5個樣本分別評分，取平均值。

1.3.4 肺組織馬松( Masson) 染色法檢測膠原增殖程度 取1.2.3項下每組切片，用二甲苯脫蠟2次，15 min/次，用高濃度到低濃度酒精脫水，溫水漂洗后按Masson試劑盒說明書操作。置于顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，參照文獻[10]用單盲法觀察肺纖維化程度并計分：0分，肺泡結構清晰、間隔正常，無腫脹；1～2分，肺泡輕微腫脹、有少量纖維化出現；3～4分，肺泡壁增大，出現小面積纖維灶；5～6分，纖維化區域增大，出現連續的纖維灶；7～8分：肺泡結構破壞顯著，纖維灶融合，出現連續大片的纖維灶；9～10分：肺泡空隙消失，肺泡腔充斥大量纖維，肺完全纖維化，每組5個樣本分別評分，取平均值。

1.3.5 羥脯氨酸試劑盒測定膠原蛋白含量 取1.2.2中的右肺，于4 ℃冰箱中解凍后，取100 g勻漿，參照文獻[12]取按堿性水解法裂解組織，離心后取上層清液1 mL，按羥脯氨酸試劑盒說明書進行測定。

1.3.6 Western blot法檢測肺組織通路蛋白p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR及自噬相關蛋白 beclin-1、p62 、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白的表達 取1.2.2中-80 ℃保存的右肺組織，于4 ℃冰箱中解凍后，剪取0.5 g，用組織勻漿器勻漿、離心分離后，取上層清液，用蛋白裂解液裂解離心后提取蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白總濃度，取50 μg蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗(p-PI3K、PI3K、p-mTOR、mTOR、p-AKT、AKT、beclin-1、p62、LC3-Ⅱ、LC3-I，β-actin(內參)抗體，稀釋倍數分別為1∶1000，1∶1000，1∶1000，1∶1000，1∶2000，1∶1000，1∶2000，1∶2000，1∶2000，1∶2000，1∶2000，4℃搖床室溫孵育過夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數1∶2000)，37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

2 結果

2.1 大鼠一般行為觀察 對照組大鼠毛色光潔，呼吸、飲食正常，活動良好。PF組大鼠隨時間延長，呼吸喘促、毛色粗糙、飲食減少、形體消瘦、精神萎靡，鼠爪和鼠尾出現紫紺。益肺散結方各劑量組呼吸喘促次數減少、飲食量均明顯好于PF組。

2.2 大鼠肺組織病理損傷程度及炎性評分檢測 對照組大鼠肺組織肺泡結構清晰正常。與對照組比較，PF組大鼠肺組織可見肺泡融合、間隔顯著增寬，炎性細胞大量浸潤，且有成纖維細胞增生堆積擠，炎性評分增高(P<0.05)；與PF組大鼠比較，益肺散結方低、中、高劑量組大鼠炎性細胞浸潤減少，肺泡結構稍紊亂，炎性評分降低(P<0.05)；益肺散結方各劑量組隨劑量增加，炎性浸潤及評分降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 HE染色檢測大鼠肺組織病理損傷(200×)Figure 1 HE staining to detect the pathological damage of rat lung tissue

表1 各組大鼠炎性程度評分和纖維化程度評分比較Table 1 Comparison of inflammatory degree score and fibrosis degree score of rats in each group

2.3 大鼠肺組織纖維化程度評分檢測 對照組大鼠肺組織肺泡結構正常。與對照組比較，PF組大鼠肺組織可見肺泡結構粘連、閉合，有大量膠原組織增殖，且纖維化程度評分增高(P<0.05)。與PF組大鼠比較，益肺散結方低、中、高劑量組大鼠，肺泡結構少量殘存，膠原纖維增殖減少，纖維化程度評分降低(P<0.05)。益肺散結方各劑量組隨劑量增加、膠原組織增殖減少及纖維化程度評分降低(P<0.05)，見圖2、表1。

圖2 Masson染色檢測大鼠肺組織病理損傷(200×)Figure 2 Pathological damage of lung tissue detected by Masson staining

2.4 各組大鼠肺組織纖維蛋白含量的影響 與對照組相比，PF組大鼠肺組織纖維蛋白含量升高(P<0.05)。與PF組相比，益肺散結方低、中、高劑量組大鼠肺組織纖維蛋白含量降低(P<0.05)，益肺散結方各劑量組纖維蛋白含量降低呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織纖維蛋白含量結果表Table 2 Results of fibrin content in lung tissue of rats in each group

2.5 各組大鼠肺組織自噬相關蛋白 beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I表達的影響 與對照組相比，PF組大鼠p62 、ɑ-SMA蛋白表達升高(P<0.05)，beclin-1和LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白表達下降(P<0.05)；與PF組相比，益肺散結方低、中、高劑量組大鼠肺組織p62 、ɑ-SMA蛋白表達降低(P<0.05)，beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達升高(P<0.05)；益肺散結方各劑量組p62 、ɑ-SMA蛋白表達降低、beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達升高呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖3、表3。

表3 各組大鼠beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/ LC3-I蛋白相對表達水平Table 3 Relative expression levels of beclin-1,p62,ɑ-SMA,LC3-Ⅱ / LC3-I protein of rats in each group

2.6 各大鼠肺組織通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達水平 與對照組相比，PF組大鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達升高(P<0.05)；與PF組相比，益肺散結方低、中、高劑量組大鼠肺組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達降低(P<0.05)；益肺散結方各劑量組蛋白表達呈劑量依賴性降低(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 各組大鼠肺組織蛋白表達免疫印跡圖Figure 3 Western blot of protein expression in lung tissue of rats in each group注：A.對照組；B.PF組；C.劑方低劑量組；D.劑方中劑量組；E.劑方高劑量組。圖A.大鼠肺組織自噬相關蛋白beclin-1、p62、ɑ-SMA、LC3-Ⅱ/LC3-I蛋白表達免疫印跡圖；圖B.大鼠肺組織通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白免疫印跡圖

表4 各組大鼠肺組織通路蛋白p-PI3k/PI3k、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表達水平Table 4 The relative expression levels of p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT,p-mTOR/mTOR protein

3 討論

PF確切發病機制不明，對于PF的治療尚無特效藥物[11]。西醫研究發現，成纖細胞增殖及胞外基質在肺組織的過度沉積是PF的主要病理表現[10]。中醫將PF歸屬為肺痹、肺痿、喘證等，且多以益氣養陰、祛痰、止咳等方法治療[12]。中醫單方、驗方、成藥等在緩解PF患者癥狀、延緩患者生存方面具有其獨特的優勢[13]。文獻報導，運用益氣養陰、散結化瘀方法及中藥黃芪提取物在治療PF方面有較好效果[14]，而中醫驗方益肺散結方具有益氣養陰、化痰止咳功效，方中黃芪又為君藥，故本研究推測益肺散結方也可能治療PF，并建立大鼠PF模型對此進行驗證，發現與對照組相比，PF組大鼠毛發稀疏，呼吸困難加重，HE及Masson 染色顯示肺組織炎性及膠原增殖程度等病理損傷評分升高，且羥脯氨酸試劑盒檢測膠原蛋白含量也明顯升高，提示大鼠PF造模成功。而給予益肺散結方低、中、高劑量治療后發現，大鼠呼吸困難現象緩解，肺組織炎性損傷、膠原增殖及含量也均比PF組降低，且益肺散結方各劑量組上述指標降低效果呈劑量依賴性增強，表明益肺散結方可降低PF大鼠肺組織膠原蛋白含量，緩解肺纖維化進程。

細胞自噬能夠提高肺泡細胞生存能力，延緩PF進程[6]。Beclin1是自噬體形成過程中的重要分子[15]。LC3-II/LC3-I 比值大小可評估自噬水平的高低[16]。p62 參與泛素蛋白酶系統和自噬蛋白降解過程[17]。自噬缺陷可促進ɑ-SMA蛋白表達[18]。PI3K/Akt/mTOR參與肺纖維化進程中的自噬過程[7,10]。徐昌君等[10]發現黃芪甲苷可抑制PF模型小鼠肺組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路，提高LC3-II/LC3-I、Beclin1自噬蛋白表達，降低ɑ-SMA和p62蛋白表達，增強肺組織細胞自噬活性，來抑制肺纖維化進程；He等[19]發現抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路表達，可提高LC3-II/LC3-I、Beclin1自噬蛋白表達，降低p62蛋白表達，促進肝癌細胞的自噬與凋亡。本研究發現與對照組相比，PF組大鼠p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR通路蛋白表達升高，而自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表達降低、ɑ-SMA和p62表達升高，提示PF模型大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR信號通路激活，自噬活性下降。而給予益肺散結方低、中、高劑量治療后發現，大鼠肺組織p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR通路蛋白表達降低，自噬蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表達升高、ɑ-SMA和p62表達降低，且益肺散結方各劑量組呈劑量依賴性，表明益肺散結方可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路表達，提高肺組織細胞自噬活性，緩解肺纖維化進程。這與徐昌君等[10]研究結果一致，體現了益肺散結方治療PF的優越性。

4 結論與啟示

益肺散結方可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路表達，提高肺組織細胞自噬活性，緩解肺纖維化進程，這可能為其作用機制之一。益肺散結方還可能通過其他途徑改善PF進程，本研究未設計通路抑制劑進行驗證，有待后續深入研究。