微小核糖核酸-7 調控表皮細胞生長因子受體對肝癌細胞增殖和轉移的影響

楊 鵬，何 洋，李 成，王黎洲，蔣天鵬，許國輝，周 石

肝細胞肝癌（HCC）是發生在肝內膽管或肝細胞內惡性腫瘤主要類型，其治療方案包括手術切除、介入治療、放化療、生物治療、靶向藥物治療等［1］。目前很多研究表明諸多癌癥發生和發展與微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）在體內表達增多有一定聯系［2］，甚至限定某種特定 miR 表達增多，可能與某種特定癌癥有著單一對象聯系［3］。其中不同miRNA又大致分為兩種，一種起類癌基因作用，另一類起抑癌基因作用［4］。有研究發現 miR-7 在肝癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌中表達均有所下降，因此起到抑癌基因作用［5-6］，但具體作用機制未完全明確。表皮細胞生長因子受體（EGFR）可在大多數腫瘤中過度表達和/或突變，與腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移、血管生成密切相關［7］。近年臨床研究證實EGFR存在于許多實體瘤體中，其表達與miR-7 表達有一定關聯［8］。因此，本研究探討 miR-7 是否通過靶向調控肝癌細胞中EGFR，進而對肝癌細胞增殖和侵襲轉移產生影響，為其治療新策略提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

將HepG2 人肝癌細胞株（美國菌種保藏中心ATCC）置于10%胎牛血清（FBS）并加入100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL 青霉素的Roswell Park 紀念研究所（RPMI）培養基，在 37℃、5%CO2培養箱中培養，觀察細胞生長為80%時進行細胞傳代。

1.2 細胞轉染和熒光定量聚合酶鏈反應檢測

在線數據庫（Http：//www.xnicroma.org/microma/home.do）查找相應資料，確定EGFR 是否為miR-7目的基因；從Ensembl 網站查找EGFR 基因序列，再將找到的條件合適的基因序列復制到Primer designing tool 網站設計合適引物，方便為下一步聚合酶鏈反應（PCR）實驗做準備。將HepG2 人肝癌細胞分為miR-7 上調組和miR-7 下調組，其中上調組又分為激動劑組（mimic）、激動劑陰性對照組（mimic negative）、空白對照組（mock）；下調組又分為抑制劑組（inhibitor）、抑制劑陰性對照組（inhibitor negative）、空白對照組（mock）。

在6 孔細胞培養板中接種適當數量HepG2 人肝癌細胞，密度為30%～50%。準備mimic-Lipo2000混合液：稀釋制備micro RNA mimic 50 μL，稀釋制備 Lipo2000 250 μL，室溫孵育 5 min；二者混勻，室溫孵育 20 min。將混合液加入培養孔中，37℃、CO2培養箱中培養，48～72 h 后測序。進入 Ensembl 網站查找miR-7 基因序列，條件合適的基因序列復制至Primer designing tool 網站設計合適引物。引物序列見表1。

表1 引物序列表

取 TRIzol 裂解液（美國 Invitrogen 公司），按 1∶0.2比例加入氯仿，將混合后的TRIzol 裂解液轉移至離心管中，離心管中加入事先培養好的肝癌細胞，37°恒溫水浴鍋孵育10 min，放入4℃離心機，10 000 r/min離心10 min。離心后取上層無色透明相，進行RNA沉淀。將無色透明相放入新Eppendorf 管中，加入等體積異丙醇，37°恒溫水浴鍋孵育10 min，隨即放入 4℃離心機，10 000 r/min 離心10 min。棄上清，按1∶1.5 比例加入TRIzol 裂解液和75%乙醇對蛋白進行清洗，放入4℃離心機，6 000 r/min 離心5 min。采用紫外吸收法進行RNA 質量檢測，讀取其在260～280 nm 處吸收值。

1.3 蛋白印跡法檢測EGFR 表達

采用放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解緩沖液（北京百泰克生物技術公司）從HepG2 人肝癌細胞分離總蛋白。采用二辛可酸（BCA）測定試劑盒（美國BioTek 公司）測定蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）（碧云天生物技術研究所）分級分離總蛋白（20 μg），轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國 Millipore 公司）。含 0.1%Tween溶液的 Tris 緩沖 0.9%NaCl 溶液（TBST）和 10%脫脂奶粉在室溫下封閉PVDF 膜1 h，阻斷非特異性位點。4℃下將膜與小鼠抗人EGFR 單克隆一抗（1∶1 000，ab155944）和小鼠抗人 GADPH 單克隆一抗（1∶1 000，ab9484，英國 Abcam 公司）孵育過夜。TBST 洗滌膜3 次，并與山羊抗小鼠IgG 辣根過氧化物酶偶聯的二抗體（1∶3 000，ab6789，英國 Abcam 公司）室溫下再孵育2 h。TBST 洗滌3 次，采用增強的化學發光溶液（美國Thermo Fisher 科技公司）使膜可視化。

1.4 溴化噻唑藍四氮唑法實驗

每組細胞轉染24 h 后，磷酸緩沖液（PBS）清洗一遍，選用胰酶消化細胞，進行細胞計數，按每200 μL含 200 個細胞計數鋪96 孔板，各組細胞鋪8 個復孔，共 4 塊 96 孔板，置于 37℃、CO2培養箱中培養。設 定 0 h、24 h、48 h、72 h 4 個 時 間點 。在 細 胞miRNA 或siRNA 轉染48 h 后每孔加入溴化噻唑藍四氮唑（MTT）溶液 20 μL，37℃孵育 4 h；棄上清，每孔加 150 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解（美國 Sigma-Aldrich 公司） 10 min，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）讀數器（美國 BioTek 公司）檢測 490 nm 處吸光度（OD），根據OD 值計算細胞增殖率（細胞增殖率＝每天細胞MTT OD 值/0 d 細胞 MTT OD 值×100%）。

1.5 劃痕試驗

先用記號筆做好標志，每隔0.5 cm 畫一橫線，每孔至少穿過5 條線。HepG2 人細胞置于CO2飽和濕度培養箱中，定期更換培養液，37℃保溫培養。將細胞接種在孔板中，待其生長至表面融合時，用無菌槍頭在表層細胞上均勻劃痕，隨后用PBS 輕柔洗滌。以 0 h、24 h、48 h 為時間點，觀察不同時點細胞遷移情況，顯微鏡下觀察并計數。

1.6 數據分析

采用SPSS 19.0 軟件對實驗數據進行計算和分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計量資料及組間和組內比較用相關性分析檢驗，計數和等級資料分析用卡方檢驗和秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染效率

熒光定量PCR 證實，miR-7 經脂質體轉染后在HepG2 細胞內轉染成功，EGFR mRNA 表達與miR-7呈 負 相 關 。mimic 組 、mimic negative 組 、mock 組EGFR mRNA 表達量分別為 1213±0.97、0.36±0.12、0.58±0.3； mimic 組與 mimic negative 組、mock 組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。inhhibitor 組、inhhibitor negative 組、mock 組 EGFR mRNA 表達量分 別 為 1.8±0.56、0.44±0.32、4.03±0.76； inhhibitor組與 inhhibitor negative 組、mock 組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 EGFR 表達

蛋白印跡法觀察顯示，miR-7 表達同樣與EGFR表達呈負相關。在上調組，EGFR 在mimic 組表達下調，mimic negative 組和 mock 組次之，在下調組，EGFR在inhibitior 組表達上調，mimic negative 組和mock組次之；mimic 組、mimic negative 組、mock 組 EGFR平均光密度值表達量分別為 0.43±0.03、0.28±0.26、0.21±0.04，mimic 組與 mimic negative 組、mock 組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）；inhhibitor 組、inhhibitor negative 組、mock 組 EGFR 表達量分別為 0.21±0.05、0.32±0.02、0.19±0.03，inhhibitor 組與 inhhibitor negative組、mock 組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 miR-7 對肝癌細胞生長的影響

MTT 試驗結果顯示，在高表達組，隨著miR-7表達上調，肝癌細胞增殖速度明顯減慢；在低表達組，隨著miR-7 表達下調，肝癌細胞增殖速度明顯增快，見表2、圖3。

2.4 miR-7 對肝癌細胞侵襲速度的影響

劃痕試驗結果顯示，在高表達組，mock 組劃痕速度最快，隨后依次為mimic negative 組、mimic 組；在低表達組，inhibitior 組劃痕速度最快，隨后依次為inhibitior negative 組、mock 組，見圖4。

3 討論

肝癌具體發病機制有諸多可能，目前認為最基本發病機制當屬原癌基因與抑癌基因關系失衡［9-11］。有研究證實miRNA 與原發性肝癌發展有著十分密切聯系［12］。EGFR、 血管內皮細胞生長因子受體（VEGFR）、肝細胞生長因子受體、成纖維細胞生長因子受體等，尤其是VEGFR，是目前公認的最有效的肝癌靶向藥物［13］。基于以上研究，本研究選擇EGFR作為目的基因，通過相關調節因素miRNA，觀察是否能控制EGFR 表達，進而從側面印證EGFR 可能作為肝癌治療的一有意義靶點。

圖1 EGFR mRNA 在上調各組和下調各組轉染情況

圖2 EGFR 在miR-7 中表達和蛋白印跡檢測結果

表2 不同組間肝癌細胞增殖速度 ±s

表2 不同組間肝癌細胞增殖速度 ±s

**與 mimic 組相比，P＜0.01； △△與 inhibitor 組相比，P＜0.01

24 h 48 h 72 h組別 0 h高表達組mimic 0.145±0.376 0.180±0.342 0.227±0.384 0.434±0.394 mimic negative 0.133±0.235** 0.207±0.784** 0.267±0.483** 0.665±0.482**mock 0.135±0.456** 0.208±0.383** 0.302±0.732** 0.665±0.722**低表達組inhibitor 0.243±0.566 0.277±0.382 0.604±0.783 0.845±0.345 inhibitor negative 0.184±0.320△△ 0.204±0.872△△ 0.306±0.982△△ 0.628±0.837△△mock 0.154±0.273△△ 0.187±0.823△△ 0.233±0.739△△ 0.526±0.642△△

圖3 肝癌細胞在不同組間增殖速度

圖4 肝癌細胞在不同組中的侵襲速度

miRNA 家族中miR-7，主要充當抑癌基因的作用。有研究顯示，其具有控制腫瘤細胞生長、轉移及抑制細胞分化的作用［14］。miR-7 同時還與體內多條信號轉導通路相關，通過參與不同通路過程對體內不同生物活動和內環境穩態進行調節［15］。miR-7 可在包括肝癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、膠質瘤、腸癌等多種腫瘤發展過程中起到關鍵作用［15］。有研究顯示，miR-7 可通過抑制EGFR 表達抑制乳腺癌細胞增殖和遷徙［16］。本研究發現 miR-7 在 HepG2細胞轉染成功后，熒光定量PCR 檢測顯示EGFR mRNA 表達量與miR-7 呈負相關，蛋白印跡檢測也證實 miR-7 表達與 EGFR 表達呈負相關，說明EGFR 極有可能是原發性肝癌的關鍵基因之一；與之前報道［16］不同的是，驗證了miR-7 同樣可通過調控EGFR 抑制肝癌細胞增殖和遷移。

近期有研究發現miR-7 可改變黏著斑激酶磷酸化及基質金屬蛋白酶表達，從而介導肝癌細胞浸潤和轉移［17］。本研究通過 MTT 試驗和劃痕實驗發現，miR-7 高表達mimic 組中肝癌細胞增殖和轉移速度明顯低于陰性和空白對照組，miR-7 低表達inhhibitor 組中肝癌細胞增殖和轉移速度明顯高于陰性和空白對照組；表明肝癌細胞中EGFR 表達對于細胞增殖和遷徙均有一定的調控作用，且受到內源性miR-7 影響。

本研究結論認為，miR-7 可通過直接靶向調節EGFR 蛋白表達，進而對肝癌細胞增殖和侵襲轉移產生負相關調節影響，可能是未來肝癌治療新策略的潛在靶點。