RNA-seq技術分析宮頸癌與癌旁組織差異表達基因效果

譙 敏 黃樹峰 武艷玲

廣東省深圳市南山區蛇口人民醫院婦科 518000

在婦科病惡性病變中宮頸癌是最常見的一種，誘發宮頸癌的高危因素是人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染，但僅會在HPV持續感染致使細胞基因組出現異常后，方可最終誘發宮頸癌[1-2]。此次研究收集2019年7月—2020年6月本院收治的3例確診為宮頸癌的患者，擬通過RNA-seq技術對宮頸癌及癌旁組織轉錄組進行分析，甄別出存在差異表達的基因，并進一步對與差異表達基因相關的融合基因、信號通路進行深入分析，進而明確宮頸癌的發病機制及特異分子標志物，為臨床治療及相關藥物研究提供一定參考，報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2019年7月—2020年6月本院收治的3例確診為宮頸癌的患者為分析對象，患者術前未接受藥物治療及放化療治療，病理學檢查結果為宮頸癌ⅡB期，術后取宮頸癌及癌旁組織放置在RNA保存液中保存，其中癌旁組織與癌灶邊緣距離在3cm以上。

1.2 提取RNA與質檢 嚴格按照操作說明書通過QIAGEN微量RNA提取試劑盒進行宮頸癌及癌旁組織RNA提取，RNA完整性及純度通過瓊脂糖凝膠電泳法進行分析，RNA純度應用Nanodrop檢測，RNA濃度通過Qubit2.0予以精確定量，RNA完整性應用Agilent2100予以精確檢測[3]。

1.3 構建文庫與測序 真核生物mRNA應用Oligo磁珠富集，將fragmentationbuffer加入其中打斷mRNA為短片段，mRNA為模板，通過六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，將DNA polymerase I、dNTPs、RNase H、緩沖液加入合成二鏈cDNA，通過A MPure XP beads 進行雙鏈cDNA純化。然后對純化后的雙鏈cDNA先行末端修復，再通過A MPure XP beads選擇片段大小。PCR擴增并通過A MPure XP beads對PCR產物純化，獲得文庫。構建完文庫后，先通過Qubit2.0初步定量，文庫稀釋，通過Agilent2100檢測文庫插入片段，通過Q-PCR法精準定量文庫有效濃度。文庫檢測達標后通過Illumina測序平臺予以測序。

1.4 測序數據分析 測序數據質量集中在Q30以上，去除原數據中涉及有低質量堿基、接頭信息、未檢出堿基，獲取最終有效數據。通過TopHat2軟件序列對比參考基因組及獲取的數據，比對至目標參考基因組上的通路稱為Mapped Reads，通過Cufflinks軟件轉錄本拼接Mapped Reads，并對宮頸癌及癌旁組織中的基因表達量進行計算。

1.5 篩選差異表達基因 通過Cufflinks軟件分析，在檢測樣品差異表達RNA期間，將FDR<0.05且差異倍數(Fold Change)≥2定位篩選標準，Fold Change為兩樣品之間表達量比值。

1.6 分析差異表達基因本體與通路富集 通過IPA軟件分析兩組樣本差異表達基因疾病功能富集、信號通路富集，通過軟DAVID工具分析基因本體。

1.7 融合基因分析 通過TopHat fusion 進行分析，將未比對成功的通路打碎為25bp的片段，繼而通過Bowtie把25bp片段比對至基因組，找到比對至同樣染色體但位置不同的reads或比對至兩個不同染色體的片段。

2 結果

2.1 差異表達基因分析 對比宮頸癌組織及其癌旁組織，總共發現差異表達基因1 746個，與癌旁組織相比，宮頸癌組織中表達量上調基因有754個，表達量下調基因992個。

2.2 基因本體及通路分析 差異基因中總計富集基因本體-BP582條，總計富集通路378條，差異基因主要富集在DNA損傷、細胞黏附相關的信號通路上，其中前5條最有意義的信號通路富集結果見表1。

表1 前5條最有意義的信號通路富集結果

2.2 融合基因分析 宮頸癌及癌旁組織中存在的融合基因詳見表2。

表2 融合基因分析

3 討論

高危型HPV持續感染雖然是誘發宮頸癌的最主要因素，但最終發展為宮頸癌的感染者也只是一小部分[4]。現階段大量研究指出[5-6]，基因水平表達存在異常會直接導致宮頸癌。RNA-seq技術除了能對已知基因轉錄活動進行檢測，還可對未知基因進行檢測。

本文中，經RNA-seq技術分析共發現差異表達的基因有1 746個，其中表達上調基因754個，表達下調基因992個。功能富集性分析結果顯示，差異基因中總計富集基因本體-BP582條，總計富集通路378條，差異基因主要富集在DNA損傷、細胞黏附相關的信號通路上。其中前兩位通路都與細胞滲出及黏附密切相關，同時在細胞滲出與黏附中，細胞黏附分子發揮著重要作用。相關研究也指出[7]，在宮頸癌轉移侵襲及發展過程中，細胞黏附因子也與之有密切關系。在惡變程度不同的宮頸癌中，活化白細胞黏附分子表達存在著差異，并且表達量表現出上升的趨勢[8]。因此，推測在宮頸癌發生過程中，同細胞黏附有關的信號通路在其中發揮著一定作用。

融合基因屬于嵌合基因，其編碼蛋白一般都具有致癌性，對細胞功能會產生消極影響，是主要的致癌原因之一[9]。現階段，在肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等惡性病變中均有融合基因的身影，但該領域關于宮頸癌的研究尚無報道。本文中發現，較之癌旁組織，宮頸癌組織中均有程度不一的融合基因，其中在兩個樣本中均發現有RAB22A-BCAS1。RAB22A是重要的調節囊泡運輸因子，RAB22A在肝癌、骨肉瘤、卵巢癌等多種腫瘤中存在過表達。乳腺癌BCAS1處在20q13.2區域，在乳腺癌發展中其高表達發揮著關鍵作用。此外，有研究指出[10]，BCAS1同胰腺癌、前列腺癌等也有密切關系。本文中所發現的RAB22A-BCAS1及其他融合基因是不是潛在的宮頸癌致癌基因，尚需進一步擴大樣本量予以驗證。

綜上所述，RAB22A-BCASI融合基因、細胞黏附信號通路同宮頸癌發病機制存在相關性，可能是導致發生宮頸癌的原因。