miR-432、miR-646和miR-100在骨肉瘤細胞中的表達

周中明，嚴小虎，梁 磊

骨肉瘤是一種最常見的原發性的惡性骨腫瘤[1]，多發于20歲以下的青少年或兒童[2]，在小兒骨惡性腫瘤中最多見，約占小兒腫瘤的5%。骨肉瘤具有高侵襲能力、惡性程度高和預后不良等特點，且男性的發病率高于女性[3]。由于其發病機制較復雜，預后差，經各種化療和輔助治療，病人5年的存活率可上升至60%～80%[4]。然而骨肉瘤的轉移性較早，且容易產生耐藥性，所以其復發和轉移的風險較高[5]。目前，臨床上對骨肉瘤的早期診斷仍很困難，生物學標志物的靈敏性和特異度均不高，導致對骨肉瘤的診斷價值欠佳，因此急需找到對骨肉瘤早期診斷的標志性物質。近年來，微小RNA(miRNA)的異常表達可影響腫瘤的發生和發展過程。miRNAs是一種高度保守的非編碼的單鏈RNA，其在機體內通過在RNA轉錄水平上結合特異性的靶基因，從而達到基因沉默的效果，充當“基因海綿”的作用，從而發揮調節功能[6-7]。相關報道證明，miR-432作為一個新發現的miRNA，在腫瘤的發生過程中發揮著調節作用，在肺癌、胃癌和宮頸癌等腫瘤組織中顯著下調[8]，但在骨肉瘤中的表達情況及作用機制尚未明確。另有研究[9-11]發現，miR-646與肝癌的發生于易感性密切相關，也被證明在肺癌、肝癌和腎細胞癌中表達降低的現象。而miR-100屬于miR-99家族的一員，可隨著人類腫瘤微環境的改變而發揮著促癌或抑癌的作用[12-13]。研究表明，miR-100在肝癌、乳腺癌和宮頸癌等腫瘤中低表達[14]，在骨肉瘤中的作用卻鮮有報道。因此，本研究通過對骨肉瘤病人中miR-432、miR-646和miR-100的表達研究，分析其與臨床病理參數的相關性，分析它們之間表達水平的相關性，為骨肉瘤的診斷、治療及預后提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年2月至2019年2月首次治療并經病理確診為骨肉瘤的72例病人作為研究對象。納入標準：(1)所有病人均經病理組織學確診；(2)所有病人的臨床資料均完整性高，且順從性好；(3)經病人及其家屬同意，簽署知情同意書。排除標準：(1)伴有高血壓、長期酗酒等病人；(2)伴有心血管、腎臟病變等病人；(3)伴有其他惡性腫瘤的病人；(4)伴有精神病病人。骨肉瘤病人男39例，女33例；年齡10～40歲；病人腫瘤直徑≥7 cm的37例，<7 cm的35例；臨床TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例。參照夏賢良等的方法計算腫瘤壞死率(tumor necrosis rate，TCNR)(%)[15]，≥90%的32例，<90%的40例。另外選取骨模型骨肉瘤旁組織38例作為對照組，所有研究過程均符合我院醫學倫理委員會的相關規定。

1.2 實驗材料與儀器 Trizol試劑由美國Invitrogen公司提供，cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green Master Mix試劑盒均由Vazyme公司提供，酶聯免疫試劑盒由ebioscience公司提供，miR-432、miR-646和miR-100引物由南京金唯智生物技術有限公司合成。引物序列見表1。主要儀器為Thermo公司生產的紫外分光光度計和TCA5020的普通PCR儀，美國ABI公司的7500-實時熒光定量PCR儀，日本SANYO公司提供的凝膠成像分析系統，美國Bio-Rad公司提供的電泳儀和電泳槽，多功能酶標儀由美國Thermo公司提供。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 實驗方法 每對組織為腫物和瘤旁組織(距離病灶≥5 cm)，在手術切除后10 min之內獲得。取材后置于無菌凍存管中，儲存于-80 ℃。應用RT-PCR法檢測miR-432、miR-646和miR-100的表達水平。用Trizol試劑提取組織細胞中RNA，整個過程嚴格按照操作說明書進行。提取骨肉瘤病人組織細胞和骨肉瘤旁組織細胞的RNA。miR-432、miR-646和miR-100逆轉錄引物序列為5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA TGG TT-3′。具體的逆轉錄條件為16 ℃(30 min)，42 ℃(30 min)和75 ℃(15 min)，在進行PCR反應時，先使用95 ℃變性10 min，溫度維持15 s，而后用60 ℃反應1 min，連續進行40個循環，每個反應平均進行3次。對反應管中熒光信號達到指定區域經歷的循環數，即Ct值，采用U6為內參，使用相對定量法計算腫瘤組織目的基因表達水平與配對的正常組織相差的倍數，即2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(腫瘤CtmiRNA-CtU6)-(正常CtmiRNA-CtU6)。

1.4 觀察指標 對比骨肉瘤組織和骨肉瘤旁的組織細胞miR-432、miR-646和miR-100的表達差異，同時分析其與臨床病理參數之間的聯系，另外對miR-432、miR-646和miR-100表達水平的相關性進行分析。

1.5 統計學方法 采用t(或t′)檢驗、方差分析、q檢驗和Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 miR-432、miR-646和miR-100在骨肉瘤和骨肉瘤旁組織細胞中的表達水平比較 與瘤旁組相比，骨肉瘤組的miR-432、miR-646和miR-100的表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 2種組織細胞中miR-432、miR-646和miR-100的表達水平

2.2 骨肉瘤病人組織細胞中miR-432、miR-646和miR-100的表達水平與臨床病理參數特征的關系 骨肉瘤組織細胞中miR-432、miR-646和miR-100的表達水平與病人的性別、年齡、腫瘤直徑、組織學類型、發病部位和TCNR均無關(P>0.05)，而與病人的TNM分期和是否發生肺轉移相關，miR-432和miR-100表達量隨著TNM分期增加而降低，miR-646表達量Ⅲ期低于Ⅰ期和Ⅱ期，發生肺轉移病人miR-432、miR-646和miR-100表達量均低于非肺轉移病人，差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(見表2～4)。

表2 骨肉瘤病人組織細胞中miR-432的表達水平與臨床病理參數特征的關系

續表2

表3 骨肉瘤病人組織細胞中miR-646的表達水平與臨床病理參數特征的關系

2.3 骨肉瘤病人中miR-432、miR-646和miR-100的表達量間的相關性分析 Pearson相關性分析發現，骨肉瘤病人中miR-432的表達水平與miR-646和miR-100的表達水平呈正相關(r=0.76和0.79，P<0.05)，而腫瘤病人中miR-646的表達水平與miR-100的表達水平同樣呈正相關(r=0.81，P<0.01)(見圖1～3)。

表4 骨肉瘤病人組織細胞中miR-100的表達水平與臨床病理參數特征的關系

3 討論

骨肉瘤是青少年及兒童極易發生的一種常見原發性惡性腫瘤，它生長速度極快，且很容易發生遠隔器官轉移[16]。多年前，由于醫學影像技術和化療藥物未曾有效普及，臨床上大都采用截肢的手術進行治療；雖然截肢手術能夠最大程度限制腫瘤的復發和轉移，但據以往研究報道顯示，骨肉瘤病人5年內的存活率仍低于20%[17]，且大都死于肺轉移。近年來，隨著醫學的迅速發展，骨肉瘤的治療和預后得到了極大的改善。但臨床上，我國對骨肉瘤的化療療效的提高并不顯著，沒有形成一個統一、規范的化療方案。仍有接近40%的病人的化療預后不良，骨肉瘤的治療需要進一步拓展思路，尋找新的治療方法。隨著分子生物學的發展，miRNAs是近年來研究發現并成為研究熱點的一類小分子編碼RNA。miRNAa在腫瘤中有表達譜的改變[18]，miRNA可成為潛在的腫瘤診斷的生物學標志。

目前，大部分miRNA分子都是通過與靶基因的3′UTR區域結合而發揮細胞調節作用。相關研究[19]表明，miR-432在肝癌組織或細胞中表達明顯下調，過表達miR-432可顯著抑制肝癌細胞的增殖及成瘤，其中可能的作用機制是miR-432參與了Wnt/β-catenin信號通路上某個靶基因發揮著調節作用。而根據Targetscan和miRbase等軟件可預測出，miR-432對應的靶基因為人趨化因子CX3CL1，miR-432可以和CX3L1的3′UTR區域的結合位點結合，而CX3L1是屬于趨化因子家族成員，在大部分腫瘤中表現為高表達水平。miR-432通過調控CX3L1基因的活性參與腫瘤細胞增殖與侵襲過程的發生與發展。所以miR-432在其中發揮著抑癌的作用。而本文研究中也發現骨肉瘤組織細胞中的miR-432的表達水平顯著低于骨肉瘤旁組織(P<0.01)，與以上結論保持一致。miR-646也被證明在多種腫瘤細胞中表現出低表達水平，我們通過Targetscan軟件預測其靶基因為表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，多個文獻[20-22]報道顯示，EGFR在骨肉瘤中表現出高表達水平，屬于一種細胞黏附因子，在大部分腫瘤如肝癌、胃癌、肺癌和宮頸癌等組織細胞中均表現出高表達水平，且可促進骨肉瘤的發生與發展。其可能的機制是miR-646通過與EGFR的3′UTR啟動子區域結合調節了EGFR的活性，從而參與了骨肉瘤的增殖與轉移的過程，發揮著抑癌作用。而本文研究中也發現骨肉瘤組織細胞中的miR-646的表達水平顯著低于骨肉瘤旁組織(P<0.01)，與以上結論保持一致。另一種miRNA即miR-100在骨肉瘤組織細胞中表達也是顯著降低(P<0.01)。相關研究報道顯示，miR-100可通過靶基因于Polo樣激酶(polo-like kinase 1，PLK1)的表達抑制腫瘤細胞的增殖，同樣，PLK1在多種腫瘤中均表現出高表達水平，且具有促進腫瘤細胞轉移與侵襲的作用，發揮著促癌的作用，因此，miR-100通過調節PLK1的活性，發揮著抑癌作用[23]。在研究miRNA與臨床病理參數的關系中，我們發現miR-432、miR-646和miR-100均與TNM分期和是否發生肺轉移具有相關性(P<0.05～P<0.01)，說明miR-432、miR-646和miR-100與骨肉瘤的增殖與轉移密切相關。

Pearson相關性分析發現miR-432、miR-646和miR-100的表達水平之間均具有正相關。其可能的作用機制均為miR-432、miR-646和miR-100通過“海綿效應”，在mRNA水平分別與EGFR、PLKK1等靶基因相結合，而靶基因通過多種代謝途徑調節骨肉瘤細胞的增殖與發展，從而達到miRNA影響了腫瘤細胞在病人體內的變化的作用。但其具體機制仍需進一步探索。

綜上所述，miR-432、miR-646和miR-100在原發性骨肉瘤的發生與發展中發揮著至關重要的作用，不僅僅對于骨肉瘤早期的診斷和治療具有重要的臨床意義，對于骨肉瘤病人的預后提供了理論支持，但是miR-432、miR-646和miR-100的相互作用仍需要深入探討。