廈門地區9249例女性人乳頭瘤病毒基因分型檢測及結果分析

張玉鳳 雷麗云 林 云 羅 巧

1.廈門市中醫院病理科，福建廈門 361000；2.廈門市中醫院婦科，福建廈門 361000

人乳頭瘤病毒（HPV）感染是生殖器疣、宮頸癌、陰莖癌以及肛門癌等的主要病因學因素之一[1-2]。目前發現HPV 有200 多種型別，其中大約40種型別與人類常見生殖道疾病有關[3]。各種HPV 亞型的致病力也是不一樣的，而且HPV 亞型的地域分布也是不一樣的。有研究表明，超過99%的宮頸癌患者均能檢測出HPV 感染，其中最為常見的HPV 分型為HPV 16、HPV 18 高危亞型[4]。宮頸癌的發病率有逐年上升的趨勢，且發病年齡呈現年輕化的狀態，廣大婦女的身心健康己經受到嚴重的危害。然而大部分患者感染HPV后并沒有臨床癥狀，在經過相關檢測后才知曉。發展成宮頸癌需要很長的時間，從癌前病變發展成宮頸癌大約需要十多年的時間，如果在癌前病變期盡早發現并給予規范治療，那么就能有效防止宮頸癌的出現[5]。因此，了解本地區女性HPV 感染的流行現狀，對本區域女性宮頸癌及高級別宮頸上皮不典型增生的早診斷、早預防有非常重要的意義。本研究對廈門市中醫院9249例患者的宮頸拭子標本采用流式熒光雜交法進行檢測，并對檢測結果進行分析研究，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年7月～2019年6月在廈門市中醫院婦科門診就診的9249例患者作為研究對象，采用流式熒光雜交法對患者的宮頸脫落細胞進行HPV 基因檢測。患者年齡18～79歲，平均（37.8±6.3）歲。納入標準：①年齡≥18歲患者；②患者48 h 內無性生活。排除標準：①生殖系統出血者；②3 d 內存在陰道用藥史與陰道沖洗史者；③凝血功能障礙者；④嚴重器官功能衰竭者。參與本試驗項目的患者均對本研究知情同意，本研究經過廈門市中醫院醫學倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

首先用棉拭子擦去宮頸口的分泌物，然后把宮頸刷伸到宮頸口處，緊貼宮頸口順時針方向輕柔轉動4～5 周，慢慢取出宮頸刷，放入裝有細胞保存液（麥克奧迪醫療診斷系統有限公司，生產批號18030102）的洗脫管中，在管口處沿刷柄折痕將宮頸刷折斷，宮頸刷留在洗脫管中，旋緊管蓋，1 周內檢測。

1.2.2 試劑與儀器

HPV 核酸分型檢測試劑盒（上海透景生命科技股份有限公司，生產批號19A006）；核酸提取試劑（上海透景生命科技股份有限公司，生產批號19A003）；LifeECO 基因擴增儀[杭州博日科技有限公司，型號TC-96/G/H（b）C]；HPV 分析儀（美國路明克斯公司，型號Luminex200）；金屬浴（杭州奧盛儀器有限公司，型號MK-10）。

1.2.3 HPV 檢測方法

1.2.3.1 PCR 樣本處理 ①將裝有宮頸刷的樣本瓶振蕩混勻，取200 μL 脫落細胞樣本放入1.5 mL 潔凈EP 管內，14 000 r/min 離心3 min；②吸棄上清液（務必去干凈），加入200 μL 核酸提取試劑（吸取前搖勻），振蕩混勻，放入100℃金屬浴中加熱15 min；③將EP管從金屬浴中取出，14 000 r/min 離心5 min，取5 μL上清液用于PCR 擴增。

1.2.3.2 PCR 擴增 包括預混液10 μL，引物混合液5.0 μL，聚合酶0.8 μL，待檢上清5 μL，總反應總體積20.8 μL，按HPV 核酸分型檢測試劑盒說明書進行共計42個循環擴增。

1.2.3.3 雜交過程 ①打開HPV 核酸分析儀預熱，并將96 微孔銅板放置在儀器加熱板上，將溫度設定在48℃；②將裝有微球雜交液試劑瓶振蕩混勻1 min，取22 μL 微球雜交液裝入微孔雜交板內，再在孔內加入3 μL 擴增產物，并抽吸幾次混勻，貼上封板紙封嚴上機，程序如下：95℃5 min 變性，48℃30 min 雜交，48℃15 min 孵育，48°C Forever（建議1 h 內讀數）；③小心撕下封板紙，每孔快速加入鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液75 μL，加完后將封板紙重新粘好，繼續在48℃下孵育15 min；④將微孔雜交板快速轉移至預熱好的HPV 核酸分析儀上進行檢測。

1.2.3.4 結果判定 當陽性內對照Globin 信號＞150 且HPV型別特異性探針信號＞150 時，則判斷該探針對應的HPV型別為陽性；該試劑盒能檢測27種HPV亞型，分別是：6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、55、56、58、59、61、66、68、81、82、83。

1.3 觀察指標

觀察入選患者發生HPV 感染的情況，分析不同年齡段患者的HPV 感染情況，考察患者感染HPV 亞型的分布情況、單一感染及多重感染情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同年齡組HPV 基因型的感染分布情況

9249例患者中檢出陽性病例1523例，陽性率為16.47%。共分成7個年齡組，＜20歲年齡組的檢出率最高，達35.29%，其次是20～＜30歲年齡組和60～＜70歲年齡組，檢出率分別為18.77%和18.13%。＜20歲年齡組的檢出率與其他年齡組檢出率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）（表1）。30～＜40歲年齡組的HPV陽性人數占總陽性人數的占比為34.87%，20～＜30歲年齡組的HPV陽性人數占總陽性人數的占比為28.56%，40～＜50歲年齡組的HPV陽性人數占總陽性人數的占比24.95%，具體分布情況見表1。

2.2 HPV陽性患者中不同亞型的構成比分布情況

1523例HPV陽性患者中，不同亞型的構成比不同，前7 位依次為52、16、58、53、39、61、81型，其構成比分別為18.38%、10.64%、10.44%、9.32%、8.21%、7.62%、6.63%，合計71.24%，具體HPV 亞型檢出分布情況見表2。

2.3 HPV陽性患者中單一感染和多重感染的分布情況

1523例HPV陽性患者中，單一感染有1148例，占75.38%，多重感染有375例，占26.62%。其中多重感染主要是以二重感染為主，為260例，占HPV陽性患者的17.07%，占多重感染的69.33%（表3）。

表1 不同年齡組HPV 基因型的感染分布情況

表2 1523例HPV陽性患者中不同亞型的構成比分布情況

表3 1523例HPV陽性患者中單一感染和多重感染的分布情況

3 討論

HPV 是一種嗜人體皮膚和黏膜組織細胞的DNA病毒，人類皮膚、生殖道、呼吸道上皮組織都是它感染的對象，人類有多種良惡性腫瘤都與它有關。女性生殖器官惡性腫瘤中排第一位就是宮頸癌，宮頸癌和癌前病變的主要因素就是高危型HPV 的持續性感染。在某些條件下，比如機體免疫力下降或同時存在其他感染因素時，高危型HPV 的持續感染可影響宮頸上皮細胞遺傳物質DNA 穩定性，容易出現惡性增殖，形成浸潤性病變，最終導致宮頸癌[6]。女性的HPV 感染大部分都是一過性，大部分女性感染后大約在2年以內自然消退，只有少數患者會出現HPV 持續感染狀態，并導致宮頸上皮不典型增生甚至宮頸癌的發生。女性從感染HPV 到宮頸上皮不典型增生再到宮頸癌，大概要經歷10年的時間，而且只要處理得當，宮頸上皮不典型增生是完全可逆的。因此，臨床上對高危感染人群開展HPV 檢測是非常必要的，這對于盡早發現宮頸癌高危患者，對其進行早期防治有著非常重要的意義。

研究表明，HPV 感染和年齡有相關性[7-8]。本研究結果顯示，不同年齡段的HPV陽性檢出率有較大的差異，＜20歲年齡組的檢出率最高，達35.29%，其次是20～＜30歲年齡組和60～＜70歲年齡組，檢出率分別為18.77%和18.13%。＜20歲年齡組的檢出率與其他年齡組檢出率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。與國內其他學者報道[7-11]有所不同。＜20歲女性的HPV 檢出率最高，這說明HPV 感染有年輕化的趨勢，可能與其處于性行為活躍期、性健康知識缺乏及其性行為缺乏保護性措施等有關。本研究中，20～＜50歲年齡段的HPV陽性患者人數占總陽性人數的占比為88.38%，20～＜50歲年齡段處于為性活動頻繁時期，說明性生活頻繁與HPV 感染有相關性，結果與程倩[12]報道類似。有研究表明，感染高危型HPV 的婦女如果不能在絕經前清除HPV 感染，那么其在絕經后更容易發展成宮頸癌[13]，可能的原因是機體自身免疫力下降以及絕經后激素水平的改變。本研究中60～＜70歲年齡組的HPV陽性檢出率是一個小高峰，這說明臨床HPV檢測對早期防治宮頸癌非常有必要。

有研究顯示[14-15]，不同地域的HPV 亞型分布是有差異的。本研究結果顯示，1523例HPV陽性患者中，不同亞型的構成比前5 位依次為52、16、58、53、39型，與國內其他學者報道[14-18]有所不同，但相同的是在于這些報道中HPV 感染率排名前5 的亞型均包含有52、16、58型。本研究中，這前5種亞型檢出例數的占比合計為56.98%，可見廈門地區女性的HPV 感染以52、16、58、53、39 亞型感染為主，且均屬于高危型，結果與國內學者江雨等[19]報道類似。

臨床上發現有很多患者的HPV 感染是復雜多樣的。本研究結果顯示，HPV 單一感染是本研究中女性HPV 感染的主要方式，占總感染的75.38%，結果與國內其他學者[20-24]報道類似。本研究結果還顯示，多重感染占總感染的24.62%，二重感染是最主要的多重感染，二重感染占多重感染的69.33%。結果與國內學者高超等[8]報道類似。有研究認為，HPV 多重感染對人體危害更大，多重感染的患者患宮頸癌的風險更高[25]。

宮頸癌的主要原因是HPV 感染，而高危型HPV的持續感染是宮頸癌的直接病因[26]。然而進展成宮頸癌會經歷很長的時間，所以有效的篩查方法加上恰當的干預治療完全可以阻斷其發展成宮頸癌。

本研究用這種流式熒光雜交技術來檢測女性HPV 感染，不僅快捷準確，而且可以區分HPV 感染的亞型，這對本地區女性宮頸癌和生殖器疣的防治具有非常重要臨床意義。因此，后續研究應該加大HPV 感染與宮頸癌有關知識的宣傳力度，進一步推進婦女開展HPV 感染篩查及宮頸癌篩查。