CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯和疾病治療中的應(yīng)用

張思桐，黃妙惠

（福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心 福建省天然免疫生物學(xué)重點實驗室，福建 福州 350117）

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種新型基因編輯工具，是以RNA導(dǎo)向的DNA識別系統(tǒng)，可在不同生物體中高效和特異性地進行基因編輯和調(diào)控。CRISPR技術(shù)以其易于操作，可多重編輯，能夠進行高通量篩選，更強的可擴展性等成為生物醫(yī)學(xué)研究革命性的新工具。

1987年，Ishino等率先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)29nt串聯(lián)間隔重復(fù)序列，2002年Ruud等人首次使用CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat）來描述該間隔重復(fù)序列。隨后，在2005年三個研究小組發(fā)現(xiàn)CRISPR中的間隔序列與感染細(xì)菌和古細(xì)菌的病毒高度同源，2007年Barrangou等提供了Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫的第一個實驗性證據(jù)。2012年Martin等發(fā)表了與反式激活的crRNA（tracr RNA）配對的crRNA，形成了2個RNA結(jié)構(gòu)并介導(dǎo)Cas9將DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）引入靶DNA中。2013年Cong和Mali等人同時發(fā)表的開創(chuàng)性研究表明CRISPR系統(tǒng)首次完成對哺乳動物細(xì)胞的基因編輯。2016年，研究人員在CRISPR/Cas9活體細(xì)胞目標(biāo)識別和利用CRISPR/Cas9引起癌癥突變的失活方面取得了重大突破[1]。2017年，張峰等人證明CRISPR/Cas13可以靶向哺乳動物細(xì)胞中的RNA和功能，并可以作為研究哺乳動物細(xì)胞中RNA和促進治療發(fā)展的靈活平臺[2]。2018年，首次啟動CRISP/Cas9臨床試驗。2020年，首例患者接受了直接將CRISPR注射人體內(nèi)的基因編輯療法[3]；同年，諾貝爾化學(xué)獎頒發(fā)給Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna以表彰他們對CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的貢獻（CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展時間線見圖1）。 CRISPR/Cas9技術(shù)以其具有較強的特異性和高效率，并能準(zhǔn)確、快速地篩選全基因組的能力，使它在基因突變、改造、特定疾病模型建立、癌癥治療等方面成為可能，為疾病治療提供新的手段。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展時間線

1 CRISPR：細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫機制

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)的獲得性免疫系統(tǒng)[3]，可對抗侵略細(xì)菌的外源DNA、質(zhì)粒和噬菌體。含有CRISPR的生物從侵入物（噬菌體或質(zhì)粒）中獲得DNA片段，將其轉(zhuǎn)錄到CRISPR RNA（crRNA）中以指導(dǎo)切割侵入的RNA或DNA[4]，這種CRISPR免疫系統(tǒng)通過許多不同的Cas蛋白協(xié)作完成。根據(jù)其組件和作用機制的差異，CRISPR系統(tǒng)分為2大類：Class 1（包含Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型）和Class 2（包含Ⅱ、Ⅴ和VI型）[5]。其中，Ⅰ型系統(tǒng)是RNA引導(dǎo)目的基因的切割，這類系統(tǒng)需要幾個較大的復(fù)合體作為效應(yīng)蛋白；但在Ⅱ型系統(tǒng)中，只需要一種RNA引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶（例如，類型Ⅱ中的Cas9和Cpf1）來介導(dǎo)侵入物遺傳物質(zhì)的切割[6]。

系統(tǒng)分三個階段對侵入的外源DNA進行全面的免疫應(yīng)答[7]。第一階段，即獲取階段，入侵質(zhì)?；蚴删w的DNA片段被整合到宿主的CRISPR位點作為crRNA重復(fù)序列之間的間隔物。在第二階段，Cas蛋白被表達(dá)，包含獲得間隔區(qū)的CRISPR陣列被轉(zhuǎn)錄成pre-crRNA，pre-crRNA被Cas蛋白和宿主其它因子切割并加工為成熟的crRNA。成熟crRNA起到引導(dǎo)作用，crRNA 5'端區(qū)域能夠與侵入物基因組互補配對，而其3'端能夠與非編碼反式激活CRISPR RNA（tracr RN）及Cas9 蛋白形成復(fù)合物。在Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)中tracr RNA與crRNA重復(fù)序列的雜交，對于crRNA加工、Cas9結(jié)合和Cas9介導(dǎo)的靶向切割至關(guān)重要。第三階段，Cas蛋白在crRNA指導(dǎo)下識別特定靶向序列，并介導(dǎo)入侵基因組的切割，從而保護宿主細(xì)胞免受感染。大部分CRISPR系統(tǒng)依賴存在于侵入基因組中與crRNA靶位點相鄰，特異性的PAM 序列[8]。由于宿主基因組中CRISPR位點不存在這種PAM序列，從而幫助其避免Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)自我剪切[9]。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞中的作用機制

CRISPR/Cas9是細(xì)菌防止外來DNA分子入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，科學(xué)家將該系統(tǒng)作為一種靶向基因編輯技術(shù)。目前應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞的CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和guide RNA兩個部分組成。

guide RNA組件是大約100個核苷酸長度的引導(dǎo)RNA。Cas9蛋白結(jié)合到guide RNA最后約80個核苷酸位置，之后guide RNA的前20個核苷酸處于游離狀態(tài)，通過堿基互補配對與DNA雙鏈結(jié)合，此時Cas9與雙鏈DNA在PAM基序位置進行交互交聯(lián)并介導(dǎo)DNA雙鏈分離，形成蛋白質(zhì)、RNA和DNA三重復(fù)合物。其中g(shù)uide RNA的前20個核苷酸將Cas9蛋白引導(dǎo)到特定的基因組位點，通過改變這20個核苷酸序列，就可以重新定向CRISPR/Cas9打靶基因組中不同位點。復(fù)合物形成后，Cas9引發(fā)DNA雙鏈斷裂。DSB可以通過HDR和非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）修復(fù)[10]。在同源修復(fù)模板存在的情況下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過同源定向修復(fù)（homology directed repair, HDR）產(chǎn)生精確的序列修飾（例如突變、插入或更正），NHEJ則可以介導(dǎo)隨機插入或缺失突變。如果DBS存在于編碼外顯子區(qū)域時，NHEJ修復(fù)可能導(dǎo)致基因開放閱讀框移位或過早形成終止密碼子，破壞正常翻譯，造成閱讀框架紊亂和相應(yīng)蛋白滅活。研究表明NHEJ是哺乳動物細(xì)胞中DSB修復(fù)最主要的途徑且它不依賴于細(xì)胞周期[11]。機體通過HDR和NHEJ修復(fù)機制從而實現(xiàn)基因編輯作用。

隨著研究深入，CRISPR / Cas9系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在基因敲除、敲入、疾病模型建立以及基因治療；因其高效性和易操作性，在生物醫(yī)學(xué)界引起一陣研究狂潮。

3 應(yīng)用Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)研究基因功能

Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)已廣泛用于遺傳學(xué)研究，通過對基因進行定點編輯，了解特定基因作用，建立基因編輯動物模型。通過簡單地構(gòu)建一個sgRNA，與鄰近PAM基序NGG靶向位點配對，Cas9即可定位到指定DNA位點實現(xiàn)靶向剪切。有研究表明Sp Cas9基因組內(nèi)平均每8 bp就有一個PAM基序，可靶向編輯幾乎任何感興趣的基因[12]。CRISPR/Cas9技術(shù)的使用大大提高了轉(zhuǎn)基因效率：從真菌和植物到各種動物。這項技術(shù)也使得建立疾病模型變得更加容易，推進了遺傳性疾病和癌癥等疾病研究，有助于理解這些病理過程的分子機制[13]。通過引入Cas9和幾個sgRNAs可以很容易地同時編輯多個基因位點，這可以應(yīng)用于生產(chǎn)大規(guī)模的染色體重排。例如在同一染色體內(nèi)的鄰近區(qū)域創(chuàng)建一個DSB可能會導(dǎo)致DNA中間片段的靶向缺失或倒位，而在不同染色體中產(chǎn)生兩個DSB可能導(dǎo)致靶向的染色體易位[14]。這類由Cas9介導(dǎo)的靶向重排，模仿了人類疾病狀態(tài)（例如癌癥）中發(fā)生的重排，對研究疾病模型和遺傳性疾病具有重要作用。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在治療許多疾病中也越來越重要，包括艾滋病、遺傳性疾病和癌癥等。當(dāng)Cas9與含有病毒關(guān)鍵基因組sgRNA的載體一起感染細(xì)胞時，病毒基因組會被滅活或清除，從而防止感染HIV、乙肝病毒、人乳頭瘤病毒和Epstein-Barr病毒[15,16]。有研究顯示，通過CRISPR/Cas9靶向宿主基因組中編碼HIV共同受體共趨化因子受體5（co-receptor chemokine receptor 5，CCR5）使細(xì)胞產(chǎn)生HIV-1病毒抗性，從而有助于抵抗HIV感染。更具臨床意義的是，該系統(tǒng)還應(yīng)用于多種體細(xì)胞類型，如原代T細(xì)胞和造血干細(xì)胞等免疫細(xì)胞的基因治療性改變[17]。

以上證據(jù)均表明CRISPR/Cas9可通過基因編輯，修復(fù)突變或敲除特定基因，探討腫瘤發(fā)生機制，進而達(dá)到推進腫瘤治療的目的。

4 應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)修正基因突變

治療遺傳性疾病最直接方法是通過基因治療糾正導(dǎo)致該疾病的突變。眾多研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可準(zhǔn)確有效地編輯細(xì)胞基因組從而達(dá)到修正基因突變的目的。

囊性纖維化是一種主要影響肺部和消化系統(tǒng)的遺傳性疾病，主要是由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（C F T R）突變引起。有研究發(fā)現(xiàn)，通過CRISPR/Cas9編輯技術(shù)可糾正囊性纖維化患者腸干細(xì)胞中CFTR位點突變[18]。被校正的基因能夠正常表達(dá)，恢復(fù)了因CFTR突變引起的腸干細(xì)胞類器官腫脹。

β-地中海貧血癥是常見的單基因遺傳病，由人血紅蛋白beta（HBB）基因突變引起，突變抑制紅細(xì)胞產(chǎn)生足夠的含氧血紅蛋白分子從而導(dǎo)致貧血。有研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)和piggy-Bac轉(zhuǎn)座子將校正DNA序列定位到HBB突變位點，有效修正兩種不同的β-地中海貧血突變，而且經(jīng)過校正的iPSC分化成紅細(xì)胞時，HBB表達(dá)恢復(fù)[19]。

這些研究表明CRISPR/Cas9技術(shù)可以給未來疾病治療方面提供一個新的策略。最近的幾項研究也證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于來糾正小動物模型的遺傳性疾病。

膠質(zhì)瘤是一種常見但原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，主要由機體攜帶端粒酶基因（TERT）啟動子區(qū)域的致癌突變引起，有研究發(fā)現(xiàn)，以腺相關(guān)病毒（AAV）作為載體，通過CRISPR/Cas9技術(shù)進行有效編輯，可以有效抑制小鼠移植瘤的生長，并延長了小鼠的生存時間，從而實現(xiàn)精準(zhǔn)修正膠質(zhì)瘤細(xì)胞端粒酶基因啟動子區(qū)域的致癌突變[20]。

利用Cas9 mRNA和sgRNA共注射到杜氏肌營養(yǎng)不良（DMD）小鼠體內(nèi)，成功拯救了具有肌營養(yǎng)不良蛋白突變的小鼠[21]。同時有研究利用CIRSPR/Cas9技術(shù)通過HDR糾正了小鼠肝細(xì)胞中的Fah突變[22]，通過脾臟注射將校正后的肝細(xì)胞移植到HT1小鼠模型中，并證明編輯后的肝細(xì)胞可以在體內(nèi)廣泛增殖。該研究證明CRIPR/Cas9編輯在治療HT1以及其他形式的遺傳性代謝性肝病中的潛力。

這些研究都表明CRISPR/Cas9技術(shù)在修正基因突變，治療遺傳性疾病方面具有可行性，為未來疾病治療研究提供一個可靠的技術(shù)支持。

5 CRISPR/Cas9的風(fēng)險和局限性

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)給基因治療帶來了新的藍(lán)圖，人們希望通過人為地敲除或改造基因，從而達(dá)到改善或治療疾病的目的。但在目前CRISPR/Cas9技術(shù)還存在一些不足，主要有以下幾個問題。

5.1 脫靶影響

CRISPR/Cas9技術(shù)最主要挑戰(zhàn)就是脫靶現(xiàn)象。非目標(biāo)突變對CRISPR/Cas9技術(shù)的使用提出了不確定性，特別是在基因治療的情況下。在過去幾年，研究人員試圖通過優(yōu)化sgRNA或人工修飾來改善Cas9的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如PAM結(jié)構(gòu)[23]。此外，通過對抗CRISPR蛋白進行研究，旨在能設(shè)計出一種有用的Cas9開關(guān)，限制Cas9在細(xì)胞核中的活躍時間，從而避免不必要的脫靶影響。

5.2 錯義敲除或插入

Cas9切割后DNA靶向修復(fù)，觀察到很少發(fā)生小的插入和缺失（＜20 bp）。然而，在一些研究中出現(xiàn)了600 bp序列缺失和高達(dá)1500 bp不需要的序列缺失，這可能導(dǎo)致不必要的病理損害，也會導(dǎo)致正常組織或細(xì)胞表達(dá)出現(xiàn)障礙[24]。

5.3 傳遞效率

Cas9在細(xì)胞或組織中的傳遞效率是影響CRISPR基因編輯成功的另一關(guān)鍵原因。CRISPR/Cas9技術(shù)主要通過包含有Cas9和sgRNAs的質(zhì)?；虿《据d體進行編輯。腺相關(guān)病毒載體是Cas9載體中最常用的載體，可以促進基因轉(zhuǎn)移，然而AAV載體會因為所包裝轉(zhuǎn)基因的大小而受到限制[25]。此外，mRNA和蛋白質(zhì)在體內(nèi)的傳遞方式，例如未能如期到達(dá)靶細(xì)胞，或者觸發(fā)人和動物體內(nèi)RNA敏感的先天免疫反應(yīng)繼而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[26]。已有研究表明，通過改進CRISPR組分和傳遞方式的性能，如使用能攜帶sgRNA和Cas9蛋白的納米粒子作為載體，可以提高體內(nèi)基因編輯的效率[27]。

另一個亟需解決的重要問題是與人類使用CRISPR技術(shù)有關(guān)的倫理安全，不管是現(xiàn)在還是未來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍然是人們用于體內(nèi)外研究疾病治療相關(guān)一種重要的技術(shù)和平臺，因此必須制定適當(dāng)?shù)膫惱砗捅O(jiān)管準(zhǔn)則來嚴(yán)格把控這項技術(shù)的合理使用。

6 展望

基因編輯被認(rèn)為是在基因組水平上治療疾病的一種有力的現(xiàn)代科學(xué)工具。CRISPR/Cas9技術(shù)以其操作簡單、更具成本效益，可在體內(nèi)外不同物種進行特異性基因敲除、插入和替換等優(yōu)勢，被人們廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷、治療和預(yù)防上，是生物醫(yī)學(xué)研究和基因治療一次巨大的技術(shù)革新。

目前，利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立遺傳性疾病模型已成趨勢，對細(xì)胞基因功能、癌癥和其他疾病基因組變化研究有著重要意義。已有科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建出老鼠、猴子和豬等多種動物模型進行研究，CRISPR/Cas9技術(shù)在作物遺傳育種、植物基因改造和農(nóng)作物品種改良等多個方面也發(fā)揮著重要作用。

盡管CRISPR/Cas9技術(shù)在多個領(lǐng)域運用效果顯著，但還是存在一些需要克服的困難，比如減小脫靶效應(yīng)、提高編輯效率和臨床治療中安全倫理等問題仍然是該技術(shù)在未來實際應(yīng)用中最需要解決的事情。近來已有研究表明，載體或質(zhì)粒的大小對CRISPR內(nèi)切酶對靶基因的有效性和傳遞有顯著影響[28]。因此，選擇具有良好穿透性和較低宿主免疫激活性的載體，有利于將CRISPR/Cas9技術(shù)運用于更多疾病的治療。

接下來科學(xué)家們將繼續(xù)研究以提高基因靶向的準(zhǔn)確性和效率，提高向特定細(xì)胞、組織或器官的傳遞性能，增強體內(nèi)Cas9活性時間和區(qū)域，加強對基因編輯引起不良突變的預(yù)測和治療效率。我們有理由相信，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以在現(xiàn)有技術(shù)手段下進一步改進醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、胚胎學(xué)以及生物信息等領(lǐng)域的發(fā)展，對研究各種遺傳疾病的生物學(xué)和病理生理機制起到巨大的推動作用，對人類健康發(fā)展更來更多的福音。