梔子葉乙醇提取物對B16黑色素瘤細胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影響

黃 碩 劉 風

廈門市第五醫院麻醉科，福建廈門 361101

近年來，由各種原因引起的色斑、皮膚衰老等問題受到人們越來越多的關注，而黑色素過度沉著是導致皮膚出現色斑的主要原因[1]。黑素細胞中的酪氨酸酶調控黑色素的生成[2]，同時也是生物體合成黑色素起始反應過程中最重要的限速酶[3]，因此，許多皮膚美白劑通過抑制酪氨酸酶活性抑制黑色素的生成來達到美白的功能[4]。由于天然產物具有安全、溫和、環保等優點[5]，因而從天然植物中提取功效成分以改善皮膚色素沉積，已成為目前護膚產品開發的主要趨勢[6]。

梔子葉來源于茜草科植物梔子（Fructus Gardeniae）的干燥葉[7]。梔子分布于我國海拔10～1500 m 處的曠野、丘陵、山谷、山坡、溪邊的灌叢或林中[8]，其果實已收入《中國藥典》并廣泛應用于臨床[9]。而其葉在我國廣西、四川等地民間廣泛應用于治療燙傷、跌打損傷、血瘀等[10]。有報道稱，梔子葉含去羥梔子苷、梔子苷[11-12]。但到目前為止，國內外對該屬植物的藥理研究還不夠系統和深入，梔子葉中有效成分的藥理學作用尚未充分揭示。本實驗通過檢測梔子葉70%乙醇提取物對α-促黑色素細胞激素（α-MSH）誘導的B16黑色素瘤細胞增殖活性、細胞內酪氨酸酶活性及黑色素生成的作用，期望為梔子葉美白護膚功效產品的開發提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料 梔子葉由廈門鷺燕大藥房有限公司提供，經廈門市第五醫院藥劑科鑒定為茜草科植物梔子（Fructus Gardeniae） 的干燥葉，自然陰干后粉碎，過20 目篩，4℃儲藏備用。曲酸、二甲基亞砜、左旋多巴（L-DOPA）、α-MSH 均購自美國Sigma 公司。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM 培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶（含0.02% EDTA）（購于Gibco 公司）。1.1.2 儀器 3111型CO2培養箱（美國Thermo 公司）；Spectra Max M5型多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；FD-1A-50型冷凍干燥機（上海繼譜電子科技有限公司）；旋轉蒸發儀（德國Heidolph 公司）

1.2 細胞培養

B16黑色素瘤細胞購自于中科院上海細胞所。常規培養于含10% FBS、100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM 培養基，在5% CO2及37℃培養箱中培養。細胞接種在96 孔及6 孔板的細胞密度分別為1×104cells/孔、2.5×105cells/孔，細胞均處于對數生長期時用于進一步實驗。

1.3 梔子葉有效成分的提取方法

取梔子葉粉末10 g，晾干后，加入200 mL 70%乙醇，室溫浸泡40 min，采用水浴（85℃）回流提取1 h，過濾，將濾液置于旋轉蒸發儀，回收乙醇，得到粗浸膏，將粗浸膏用冷凍干燥機干燥至凍干粉末狀，備用。

1.4 實驗分組

酶動力學實驗分組：設置實驗組（樣本為梔子葉70%乙醇提物）和陽性對照組（樣本為曲酸）。

細胞實驗分組：設置空白組、模型組、陽性對照組和梔子葉70%乙醇提取物組[低濃度組（100 mg/L）、中濃度組（200 mg/L）、高濃度組（400 mg/L）]。梔子葉70%乙醇提取物組各組的藥物配置方法如下，取“1.3”項下的0.1 mg 提取物粉末溶于1 mL PBS 中，進行溶液配制，得低濃度組；取“1.3”項下的0.2 mg 提取粉末溶于1 mL PBS 中，進行溶液配制，得中濃度組；取“1.3”項下的0.3 mg 提取粉末溶于1 mL PBS 中，進行溶液配制，得高濃度組。

1.5 采用左旋多巴氧化法檢測酪氨酸酶活性

如“1.4”項中所述，設置酶動力學實驗分組，采用200 μL 反應體系，將30 μL 蘑菇酪氨酸酶溶液（酶活力100 U/mL）和30 μL“1.3”項中所述的梔子葉70%乙醇提取物、曲酸和PBS分別加入96 孔板中，混合均勻，37℃孵育10 min 后，迅速加入左旋多巴溶液60 μL，混合均勻，連續30 min 檢測溶液在475 nm 處的吸光度值。

酪氨酸酶活性抑制率=[1-（T1-T2）/（C1-C2）]×100%。

式中：C1：未加樣品加酪氨酸酶的反應液的吸光度；C2：未加樣品且未加酪氨酸酶的反應液的吸光度；T1：加樣品和加酪氨酸酶的吸光度；T2：加樣品而未加酪氨酸酶的吸光度。

1.6 MTS 測定細胞活力

處于對數生長期的B16黑色素瘤細胞融合度達到70%時，每孔加入200 μL 含2% FBS DMEM 培養基稀釋過的不同濃度（100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg/L）的梔子葉70%乙醇提取物，孵育24 h，加入MTS 試劑，在37℃水浴反應10 min，于5%CO2及37℃培養箱中反應60 min，在490 nm 波長處測定吸光值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=測定孔吸光值/對照吸光值×100%。

1.7 B16黑色素瘤細胞黑色素含量的測定

如“1.4”項中所述，設置細胞實驗分組，將B16黑色素瘤細胞接種于6 孔板（密度為1×105/孔，每孔1.5 mL），于5% CO2，37℃培養箱中培養24 h，棄培養液，分別取 梔 子 葉70%乙 醇 提 取 物100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg/L 濃度然后用低、中、高三個濃度的梔子葉70%乙醇提取物（如“1.4”項實驗分組所述）孵育B16黑色素瘤細胞72 h。B16黑色素瘤細胞黑色素含量的測定方法，按照文獻報道[13]進行。

1.8 B16黑色素瘤細胞酪氨酸酶活性

如“1.4”項中所述，設置細胞實驗分組，將B16黑色素瘤細胞接種于6 孔板（密度為1×105/孔，每孔1.5 mL），于5% CO2，37℃培養箱中培養24 h，棄培養液，然后用低、中、高三個濃度的梔子葉70%乙醇提取物（如“1.4”項實驗分組所述）孵育B16黑色素瘤細胞72 h。B16黑色素瘤細胞酪氨酸活性的測定方法，按照文獻報道[13]進行。

1.9 統計學方法

采用Graphpad Prism 7 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用One way-ANOVA檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗（LSD-t 檢驗）；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 梔子葉70%乙醇提取物和曲酸對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用

采用左旋多巴氧化法檢測蘑菇酪氨酸酶活性，結果顯示，實驗組的梔子葉70%乙醇提取物對蘑菇酪氨酸酶活性具有更強的抑制作用，其對蘑菇酪氨酸酶抑制作用的IC50為（0.157±0.044）mg/mL，陽性對照組的曲酸對蘑菇酪氨酸酶抑制作用的IC50為（0.054±0.018）mg/mL。

2.2 梔子葉70%乙醇提取物對B16黑色素瘤細胞活力的影響

分別取梔子葉70%乙醇提取物100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg/L 濃度，孵育B16黑色素瘤細胞72 h 后測定細胞存活率。結果顯示，隨梔子葉70%乙醇提取物濃度增高，細胞存活率逐漸降低，100～600 mg/L 濃度下，細胞存活率≥80%，視為無細胞毒性，即對體外培養的小鼠B16黑色素瘤細胞無明顯毒性；100～400 mg/L 濃度時，B16黑色素瘤細胞的存活率>90%，提示100～400 mg/L 濃度的梔子葉70%乙醇提取物對B16黑色素瘤細胞的增殖沒有影響（圖1）。因此，在后續實驗中采用低濃度（100 mg/L）、中濃度（200 mg/L）和高濃度（400 mg/L）梔子葉70%乙醇提取物來進行各項細胞學研究。

表1 梔子葉70%乙醇提取物和曲酸對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用

2.3 不同組別對B16黑色素瘤細胞黑色素含量的抑制作用

分別選取模型組、梔子葉70%乙醇提取物中濃度組以及曲酸陽性對照組，每組兩份平行組進行試驗，所得作用圖見圖2。

模型組的B16黑色素瘤細胞黑色素含量明顯高于空白組，差異有統計學意義（P<0.001）；梔子葉70%乙醇提物濃度依賴高度性地抑制B16黑色素瘤細胞黑色素的生成，梔子葉70%乙醇提取物中濃度組和高濃度組的B16黑色素瘤細胞內黑色素含量低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）；曲酸顯著抑制B16黑色素瘤細胞黑素的生成，陽性對照組的B16黑色素瘤細胞內黑色素含量顯著低于模型組，差異有高度統計學意義（P<0.001）（圖3）。

圖2 模型組、梔子葉70%乙醇提取物中濃度組、陽性對照組對B16黑色素瘤細胞黑素含量的作用

圖3 不同組別B16黑色素瘤細胞黑色素含量的比較

2.4 梔子葉70%乙醇提取物對B16黑色素瘤細胞酪氨酸酶活性的抑制作用

模型組B16黑色素瘤細胞酪氨酸活性高于空白組，差異有統計學意義（P<0.001）；梔子葉70%乙醇提物濃度依賴性地抑制B16黑色素瘤細胞酪氨酸酶活性，梔子葉70%乙醇提取物中濃度組和高濃度組的B16黑色素瘤細胞酪氨酸酶活性低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）；曲酸顯著抑制酪氨酸酶的活性，陽性對照組的B16黑色素瘤細胞內酪氨酸酶活性顯著低于模型組，差異有高度統計學意義（P<0.001）（圖4）。

圖4 不同組別B16黑色素瘤細胞酪氨酸活性的比較

3 討論

酪氨酸酶活性的過度增強，是導致黑色素異常積累的主要原因。因而，酪氨酸酶抑制劑的在護膚產品方面的的研究和開發受到了人們的廣泛關注。本研究通過檢測梔子葉70%乙醇提取物對底物左旋多巴的催化效果，間接反映酪氨酸酶的活性，結果顯示，梔子葉醇提物可抑制蘑菇酪氨酸酶活性，IC50為（0.157±0.044）mg/mL。采用MTS 檢測B16黑色素瘤細胞活力，結果顯示，梔子葉70%乙醇提取物濃度在100～600 mg/L 時，對體外培養的小鼠B16黑色素瘤細胞均無明顯毒性，100～400 mg/L 濃度時，B16黑色素瘤細胞的存活率>90%，因此，在后續實驗中采用低濃度（100 mg/L）、中濃度（200 mg/L）和高濃度（400 mg/L）梔子葉70%乙醇提取物來進行各項細胞學研究。

α-MSH是一種內源性的神經激素，由其前體激素阿片-黑皮素原（POMC）裂解而成[13]，這種由13個氨基酸組成的神經內分泌激素能夠促進黑素細胞的分裂且增強黑素細胞內酪氨酸酶表達及活性，促進黑素生成[14]，已有研究發現，角質化細胞產生的α-MSH在體內可能是黑素細胞的自然生長因子。在皮膚黑素細胞和毛囊存在多種生長因子和細胞因子以及它們的受體[15]。在本課題研究中，筆者探究梔子葉70%乙醇提取物對α-MSH 誘導的B16黑色素瘤細胞內黑色素生成和酪氨酸酶活性的作用，結果顯示，梔子葉乙醇提物濃度依賴性地抑制B16黑色素瘤細胞黑素的生成，梔子葉70%乙醇提取物中濃度組和高濃度組的B16黑色素瘤細胞內黑色素含量低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），提示梔子葉乙醇提物對B16黑色素瘤細胞的黑素生成具有抑制活性。同時，本研究結果還顯示，梔子葉乙醇提物濃度依賴性地抑制α-MSH 誘導后B16黑色素瘤細胞酪氨酸酶的活性，梔子葉70%乙醇提取物中濃度組和高濃度組的B16黑色素瘤細胞酪氨酸酶活性低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），由此可推斷梔子葉70%乙醇提取物通過直接抑制酪氨酸酶的活性降低B16黑色素瘤細胞中黑色素的生成。

綜上所述，梔子葉70%乙醇提取物是一種天然、安全和高效的黑色素合成抑制劑，為將其進一步開發為皮膚美白劑或美白添加劑提供了理論依據。但仍有諸多疑慮，如梔子葉乙醇提取物的關鍵活性成分、對酪氨酸酶的具體抑制類型和結合方式等，有待進一步探究。