養陰清肺丸微生物限度檢查方法適用性研究

王 靜 張秀花 任仲麗 盛春雷 閆世生

山東省菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東菏澤 274000

養陰清肺丸由地黃、麥冬、玄參、川貝母、白芍、牡丹皮、薄荷、甘草八種中藥組成。作為補益劑，具有養陰潤燥，清肺利咽之功效[1-2]，主治陰虛肺燥，咽喉干痛，干咳少痰或痰中帶血[3]。在2019年山東省風險監測30 批次樣品檢驗過程中，通過4個企業提供的微生物限度檢查方法適用性試驗資料發現，微生物限度檢查適用性試驗均存在方法差異，因此，通過方法適用性試驗來確定檢驗方法的可行性和有效性是十分有必要的[4]。《中國藥典》2015年版方法較之前發生了較大變化，所以為了檢驗結果的準確可靠，樣品檢驗時需要重新建立合適的檢驗方法[5-6]，并且《中國藥典》2015年版是目前常用的一種藥品質量衛生檢驗方法[7]，為確保其微生物限度檢查質量安全性達到要求[8]，本研究按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1105、1106[9]，建立養陰清肺丸微生物限度方法適用性試驗，確保檢測方法的可行性及統一性。

1 儀器與試藥

1.1 樣品

北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號為17035288；頸復康藥業集團赤峰丹龍藥業有限公司，批號為1705052；呼倫貝爾松鹿制藥有限公司，批號為181213；山西華康藥業股份有限公司，批號為2019 0202。

1.2 培養基與稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養基（批號：190518）、沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養基（批號：190625）、胰酪大豆胨液體（TSB）培養基（批號：190712）、麥康凱瓊脂（MACa）培養基（批號：170925）[9]、麥康凱液體（MACb）培養基（批號：171205）、腸道菌增菌液（EE 增菌液）（批號：180222）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號：180627）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂（XLD）培養基（批號：170804）等均由北京陸橋技術股份有限公司提供；為了使菌落能更好地生長，本研究選擇了TSB 培養基作為稀釋液[10]。

1.3 菌種

微生物計數方法適用性試驗所用菌種為金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003][9]，控制菌檢查方法適用性試驗所用菌種為大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門氏菌[CMCC（B）50094]，均由廣東環凱微生物科技有限公司提供，試驗所用菌株均為第3 代。

1.4 儀器

高壓蒸汽滅菌器（MLS-3781L-PC，山東博科生物產業有限公司）、電子天平（HZT-A600，精確度：0.01 g，沈陽龍騰電子有限公司）、生物安全柜（ClassⅡBSC，山東博科再生醫學有限公司）、生化培養箱（SPX-150B，上海博泰實驗設備有限公司）、電熱恒溫培養箱（DHP-420，蘇州正合測試設備有限公司）、細菌濁度分析儀（GXZ-0101，德國KEWILL）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

按2015年版《中華人民共和國藥典》 四部通則1105、1106[9]要求進行制備。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，加TSB 培養基至100 mL，勻漿，制成1∶10 供試液；取上述供試液1 mL 加至9 mL TSB培養基中，制成1∶100 的供試液，依法制成1∶1000 的供試液；取1∶10 供試液2 mL 加至8 mL TSB 培養基中，制成1∶50 供試液。

2.3 需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數

2.3.1 常規法 試驗組：取“2.1”項下菌液0.1 mL，加至10 mL 1∶10 供試液中，反復吹洗，混勻；供試品對照組：取供試液，以TSB 培養基代替菌液，其他同試驗組；菌液對照組：取TSB 培養基替代供試液，其他與試驗組相同。以上每組各取1 mL 注入平皿中，加入15～20 mL 對應的培養基，每個菌液平行制備2個平皿，測定菌液中的菌落數。其中，菌液不超過供試液的1%[11]，下同。2.3.2 增加稀釋液法 試驗組：取“2.1”項下菌液0.1 mL，加至10 mL 1∶50或1∶100 供試液中，反復吹洗，混勻；供試品對照組：取供試液，以TSB 培養基代替菌液，其他與試驗組相同；菌液對照組：制備同2.3.1 項下菌液組制備方法。以上每組各取1 mL 注入平皿中，加入15～20 mL 對應的培養基，每個菌液平行制備2個平皿，測定菌液中的菌落數。

2.4 控制菌檢查

2.4.1 耐膽鹽革蘭氏陰性菌 ①常規法。供試品組：分別取“2.2”項中1∶10、1∶100、1∶1000 供試液各1 mL 加入10 mL EE 增菌液液體培養基中，平行制備3份；其中兩份加入≤100 cfu 的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，作為陽性對照組，依相應控制菌檢查方法檢查；陰性對照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。②增加培養基體積法。供試品組：分別取2.2 中1∶10、1∶100、1∶1000 供試液各1 mL 加入20 mL或50 mL EE 增菌液液體培養基中，平行制備3份；其中兩份加入≤100 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，作為陽性對照組，依相應控制菌檢查方法檢查；陰性對照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。2.4.2 大腸埃希菌 ①常規法。供試品組：取“2.2”項中1∶10 供試液10 mL，接種至100 mL TSB 培養基中，平行制備2份；其中一份加入≤100 cfu 的大腸埃希菌，作為陽性對照組，依相應控制菌檢查方法檢查；陰性對照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。②增加培養基體積法。供試品組：取“2.2”項中1∶10 供試液10 mL，接種至200 mL TSB 培養基中，平行制備2份；其中一份加入≤100 cfu 的大腸埃希菌，作為陽性對照組，依相應控制菌檢查方法檢查；陰性對照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。2.4.3 沙門菌 ①常規法。供試品組：取供試品10 g，接種至100 mL TSB 培養基中，平行制備2份；其中一份加入≤100 cfu 的乙型副傷寒沙門菌，作為陽性對照組，依相應控制菌檢查方法檢查；陰性對照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。②增加培養基體積法。供試品組：取供試品10 g，接種至200 mL TSB 培養基中，平行制備2份；其中一份加入≤100 cfu 的乙型副傷寒沙門菌，作為陽性對照組，依相應控制菌檢查方法檢查；陰性對照組：以稀釋液代替供試液，其他同供試品組。

2.5 結果

2.5.1 企業微生物限度方法適用性試驗 方法適用性試驗中需氧菌總數3個企業采用常規法，1個企業采用增加稀釋液法（1∶50）；霉菌和酵母菌計數4個企業均采用常規法；耐膽鹽革蘭陰性菌3個企業采用常規法，1個企業采用增加培養基體積法；大腸埃希菌4個企業均采用常規法；沙門菌3個企業采用增加培養基體積法（200 mL），1個企業采用常規法（表1）。2.5.2 微生物限度方法適用性試驗結果 4個企業分別采用了常規法、增加稀釋液法（1∶50、1∶100）兩種稀釋級進行了方法適用性試驗，每種試驗菌回收比值均在0.5～2.0，但是增加稀釋液法比常規法回收比值高（表2）。4個企業分別采用了常規法、增加培養基體積法進行方法適用性試驗，兩種方法均呈陽性結果（表3）。

3 討論

3.1 試驗小結

藥品評價標準中微生物限度直接關系藥品自身質量，更是關系到患者的用藥安全[12]，中成藥組分相對復雜，劑型廣泛，微生物檢測方法的適用性試驗就顯得更為重要[13-15]。方法適用性試驗的本質是建立對樣品影響更小、操作率更高的方法[16]，但其本身工作量大，而且存在不同實驗室方法欠佳、重復勞動過多的問題[17]，因此同一品種建立統一合理有效的方法適用性試驗是重點。

本研究結果顯示，4個企業微生物限度方法適用性試驗均存在方法差異。針對這一問題，本研究分別對4個企業養陰清肺丸微生物限度方法適用性試驗進行驗證。本研究結果顯示，4個企業需氧菌總數3種方法回收比值均在0.5～2.0；霉菌及酵母菌總數兩種方法回收比值均在0.5～2.0，因此，4個企業的養陰清肺丸微生物計數方法適用性試驗均可采用常規法。4個企業耐膽鹽革蘭氏陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌的兩種方法均出現陽性結果，因此，4個企業控制菌檢查均可采用常規法。

表1 4個企業提供的微生物限度檢查方法適用性試驗

表2 微生物計數方法適用性試驗回收比值

表3 控制菌方法適用性試驗結果

3.2 結果分析

目前，藥品微生物限度檢查是客觀衡量藥品（主要指中藥及含有動植物提取物的品種）質量的一項重要指標[18]，主要涉及到藥品原材料及輔料的生產工藝步驟、生產環境等方面。因此，藥品微生物限度檢驗非常重要，但在檢驗過程中很容易受到各種因素影響從而發生誤差，所以，生產企業需重視人員、物品、環節及制度等各方面改善，優化質量標準，針對性加強防范和控制，確保降低誤差率[19]。

目前，全國共有48家企業生產養陰清肺丸，55個批準文號，其中成藥原藥材、功能主治一致，但劑型不同、生產企業不同，生產工藝與輔料會有所差異，最終導致抑菌活性的區別[20]。從表2 可以看出，因原料產地、批次、輔料及生產工藝存在一定差異，不同生產企業同一品種的微生物限度方法適用性試驗結果存在差異，尤其是微生物計數回收比值，盡管常規法每種試驗菌的回收比值低于培養基稀釋法，但均在0.5～2.0，符合試驗要求，為方便不同企業檢驗人員操作，可以統一采用常規法。