植物激素對植物寄生線蟲取食位點建立與發育的影響

黃文坤 于敬文 賈建平，2 彭德良

（1. 中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2. 甘肅農業大學植物保護學院，蘭州 730070）

植物寄生線蟲包括內寄生線蟲（endoparasistic nematodes）和外寄生線蟲（exoparasitic nematode）兩大類，其中根結線蟲（Meloidogynespp.）和孢囊線蟲（Heteroderaspp.）是對農業生產危害最大的兩類內寄生線蟲，能感染大多數農作物［1］。內寄生線蟲在植物根部誘導形成復雜的取食結構（feeding sites），線蟲依賴這種取食結構汲取營養，其中根結線蟲誘導形成巨細胞（giant-cells）、孢囊線蟲誘導形成合胞體（syncytium）［2］。根結線蟲具有多食性，為了完成巨細胞的發育，可以與大多數植物的生理活動互作，它們能夠“掠奪”植物基礎發育所需要的營養，如須根形成所需要的誘導物質。為了明確未感染線蟲的植物根部發育過程中的信號介導過程，通過組學技術發現成百個基因在植物與線蟲互作過程中的特異表達［3］。已有證據表明，植物寄生線蟲取食細胞的發育通過模擬或干擾植物已有的發育機制來進行。

植物激素（phytohormones）是調節植物生長和發育的小型信號分子。除5種典型的植物激素：生長 素（auxin，IAA）、乙 烯（ethylene，ETH）、細胞分裂素（cytokinin，CTK）、赤霉素（gibberellin，GA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）外，最近又發現了幾種激素：油菜素類固醇（brassinosteroids，BRs）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（salicylic acid，SA）和獨腳金內酯（strigolactones，SL）。上述植物激素參與調節許多植物生長過程，包括器官形成、分生組織功能和遠程信號傳遞等［4］。其中植物生長素能夠誘導分生組織中的細胞分裂；乙烯能夠促進線蟲取食位點形成；細胞分裂素能夠促進分生組織中的細胞分化；赤霉素促進分生組織發育及成熟；多肽類激素則參與阻礙植物細胞正常發育并介導線蟲取食位點的形成。植物激素在協調植物對互利或寄生生物的信號反應過程中起關鍵作用，這些生物體通過控制特定細胞類型的激素平衡與宿主建立起親密的互作關系。誘導線蟲取食部位的主要信號是分泌蛋白釋放到巨細胞（合胞體）中，誘導多核細胞復合物發揮營養庫的作用，這些取食位點的形成是植物基因表達的巨大變化和分化根細胞重組的結果。由于植物激素是參與基因轉錄調控的重要因素，因此直接或間接調控局部激素平衡是線蟲改變植物細胞基因表達模式的重要途徑。本文重點討論了植物激素在孢囊線蟲和根結線蟲形成取食位點的分子機制中的重要作用。

1 線蟲取食位點建立與形成

1.1 根結線蟲取食位點的發育

根結線蟲通過單個細胞擴張形成的取食細胞稱為巨細胞。巨細胞通常由圍繞線蟲前端的中柱內的薄壁細胞形成，食道腺分泌物是刺激巨細胞形成的主要分子，這些分泌物是從線蟲口針中釋放、刺穿細胞壁并與植物細胞膜接觸在膜上形成一個微小的孔，以便進入被寄生細胞的細胞質進行取食。早期研究發現根的中柱細胞和皮層細胞在線蟲周圍增殖，增加了根的周長［5］。如Wyss等［6］研究發現根結線蟲幼蟲通過穿透和破壞表皮細胞進入根部靠近根尖的伸長區，隨后遷移到分生組織，最后回到維管組織中，其頭部在靠近維管組織的伸長區進行取食。隨著取食部位的發展，它們表現為根上的膨大區域稱為根結。

巨細胞在取食位點形成血管狀組織網絡并且細胞壁向內生長以便獲得營養物質，而植物根系木質部和韌皮部都是巨細胞營養的貯存場所。在巨細胞中線蟲將獲得的營養物質儲存在富含蛋白質和脂類物質的細胞質中［7］。此外，根結線蟲誘導巨細胞細胞壁加厚、松弛來達到擴張的目的，并形成內生組織以增加質膜表面積來增加線蟲取食位點食物的獲?。?］。這種與巨細胞的擴張和功能相關的細胞壁改變是由宿主基因的誘導調節所介導的。根結線蟲誘導的巨細胞的細胞壁經過結構修飾其主要成分中含有高甲酯HG型果膠、木葡聚糖和阿拉伯聚糖［9］。巨細胞的關鍵特征包括：大量的細胞核（由無胞質分裂的重復核分裂形成）、大量的次生細胞壁向內生長（增加取食位點的表面積）和大量的細胞器包括高爾基體堆、小液泡、質體、內質網和線粒體。新形成的巨細胞含有大液泡，占細胞體積的很大一部分，而成熟的巨細胞含有小液泡，并且大部分細胞內含物是細胞質［10］。

1.2 孢囊線蟲取食位點的發育

不同種類的孢囊線蟲改變了植物的發育途徑，從而有利于其取食位點的發育。孢囊線蟲細胞壁破裂后細胞融合而產生的多核取食細胞稱為合胞體，合胞體是由相鄰細胞原生質體融合形成的，它的發育是由孢囊線蟲二齡幼蟲從皮質或薄壁細胞中選擇的單個細胞開始的［11］。當根系處于初級生長狀態時，孢囊線蟲二齡幼蟲侵入主根和側根的伸長區或根毛區。當根處于次生生長狀態并被多層外皮層或周皮覆蓋時，則很少有孢囊線蟲侵入側根形成區。

合胞體是孢囊線蟲侵染寄主后的唯一營養來源。合胞體通過在皮層細胞和內胚層細胞之間形成細胞壁開口進而向微管束擴散，這一部分被稱為“皮層橋”［12］。在合胞體中細胞質增大，液泡體積縮小，細胞核和核仁增大，內質網、核糖體、質體和線粒體含量豐富。合胞質顯著增長且流動性增加表明其代謝活動增強。合胞核增大，核仁增大，質體（前質體和淀粉體）和線粒體在合胞質中迅速增殖。合胞體細胞壁會被線蟲食道腺通過針孔釋放的細胞壁修飾蛋白混合物軟化。合胞體細胞壁顯著增厚，合胞體細胞壁在孢囊線蟲取食位點的發育有兩方面作用［13］：一方面，合胞體細胞壁維持合胞體內的滲透壓；另一方面，合胞體細胞壁保持柔韌性和滲透性，柔韌性擴大取食位點和融合新細胞，滲透性促進和維持合胞體對線蟲取食所需的營養素的吸收。

2 植物激素相關基因在線蟲取食位點的表達與調控方式

對差異表達的基因序列進行聚類分析表明，線蟲取食位點形成過程中的基因表達與植物激素有關。對孢囊線蟲［14］和根結線蟲［15］感染的植物組織的研究結果表明，植物激素在基因表達的調控和取食位點的建立中起著重要作用。

2.1 植物激素相關基因的表達方式

基因篩選和功能表征揭示了負責生長素、乙烯、細胞分裂素、赤霉素和茉莉酸識別的受體以及某些肽激素的受體參與感知蛋白質和信號傳遞［16］。通過比較不同植物激素的相關受體，我們發現膜相關受 體CRE1、BRI1和ETR1/ETR2/EIN4/ERS1/ERS2分別感知細胞分裂素、油菜素類固醇和乙烯，并激活已知的信號傳遞。相比之下，細胞核受體TIR1、GID1和COI1分別涉及生長素，赤霉素和茉莉酸信號，以及泛素-蛋白酶體途徑［17］。許多對線蟲差異表達的基因都與生長素和乙烯相關，少數基因與赤霉素、細胞分裂素和脫落酸相關［18］。研究發現孢囊線蟲誘導的合胞體過程中生長素和乙烯在取食位點發育過程中發揮作用，多肽類激素也參與了合胞體的形成［19］，植物生長素與細胞分裂素的交互作用是植物根發育中激素調節的主要方式，包括根端分生組織（RAM）的產生、須根的形成及維管束組織的發育等［20］。線蟲通過干擾上游植物激素合成的信號傳導來改變植物基本結構發育。實驗結果顯示，在根結線蟲誘導的根結中檢測到植物生長素及其前體的濃度增加，表明植物生長素在根內誘導形成的巨細胞發育過程中發揮重要作用［21］。質譜分析結果顯示，在甜菜孢囊線蟲（Heterodera schachtii）與南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）的口針分泌物中能夠檢測到植物生長素及細胞分裂素，表明兩種激素在線蟲取食位點的發育中起作用［22］。而且，通過使用報告基因的植物激素感應系統，證明了植物生長素及細胞分裂素相關基因在巨細胞、根結及合胞體的形成和發育過程中被激活。上述實驗結果表明植物激素通過相關基因特異性表達適應線蟲取食位點形成。

2.2 植物激素相關基因的調控途徑或作用

病原物干擾植物生理活動的分子機制能有效地改變植物的發育途徑，能夠促進開花控制蛋白降解的植原體毒性蛋白SAP54，在發育過程中能夠產生短暫的信號使花發育成葉，從而更好地吸引葉面媒介昆蟲有利于植原體的發育和繁殖。同樣，線蟲分泌的效應子也能干擾植物的發育途徑［23］。蛋白質組學、轉錄組學和比較基因組學的發展促進了線蟲分泌的效應子的鑒定。鑒定結果表明線蟲效應子改變根細胞中的基因表達，可能干擾寄主植物轉錄因子的活性，誘導植物激素相關基因在線蟲取食位點進行調控［24］。

2.2.1 線蟲取食位點中生長素介導的調控途徑 根結線蟲感染使植物激素相關基因轉錄激活或抑制，導致內源激素水平發生局部變化。對取食位點發育的生化研究表明，南方根結線蟲、北方根結線蟲、爪哇根結線蟲等形成的根結中出現吲哚類化合物的積累［21］。此外，通過早期激活生長素反應啟動子GH3［25］和合成生長素反應啟動子DR5［26］，可以檢測到線蟲取食位點中局部生長素水平的增加。DR5啟動子是植物根系生長素水平變化的標志，因為其含有來自GH3的多種生長素反應元件（AuxRE）［27］這種生長素反應元件由生長素反應基因所必需的5'-TGTCTC-3' DNA堿基序列組成［28］。由ARF（生長素響應因子）多基因家族編碼的蛋白質與生長素反應元件5'-TGTCTC-3'的DNA堿基序列結合，導致生長素相關基因表達的激活或抑制。

2.2.2 線蟲取食位點中乙烯介導的調控途徑 篩選出的乙烯敏感性降低的擬南芥突變體表明，乙烯介導的信號轉導在孢囊線蟲誘導的取食位點發育中發揮重要作用［29］。在線蟲誘導的取食部位，乙烯介導的信號轉導通過將植物轉錄因子家族EREBPs［30］與乙烯反應啟動子元件GCC盒結合導致乙烯反應基因表達的轉錄激活。etr1-1編碼一種位于內質網膜上的雙組分組氨酸激酶類受體，在感染顯性乙烯不敏感突變體etr1-1后，甜菜孢囊線蟲的發育明顯減弱。突變體不能與乙烯結合，這表明ETR1對乙烯的感知和下游信號轉導對合胞體形成起到重要作用。ein2突變體作用結果表明EIN2（ETHYLENE INSENSITIVE2）作為受體-CTR1復合物是乙烯信號通路的正調節因子［31］，ein2突變體的感染也導致線蟲發育停滯。ein3突變體作用結果表明其編碼參與核內乙烯反應放大的轉錄因子ein3［32］。

2.2.3 線蟲取食位點中細胞分裂素介導的調控途徑 生物測定結果表明，根結線蟲可以產生具有生物活性的細胞分裂素［33］。Lohar等［34］利用細胞分裂素氧化酶基因的轉基因表達直接調控細胞分裂素，實驗表明根結線蟲誘導的取食部位數量與細胞分裂素水平之間具有相關性。在轉基因植物中使用ARR5啟動子驅動報告子結構，當根結線蟲幼蟲到達分化的維管束（巨細胞誘導部位）時，ARR5表達增強。在巨細胞誘導的部位中細胞分裂素應答基因ARR5在分化維管束中強烈表達時，細胞分裂素在植物-根結線蟲相互作用中的積極作用明顯增強。在巨細胞中該基因在線蟲蟲癭成熟過程中被抑制，表明細胞分裂素可以在增強和抑制細胞分裂中發揮作用。細胞分裂素在巨細胞形成中的作用的直接證據是細胞分裂素氧化酶在根中的瞬時表達，該酶負責細胞分裂素的降解，導致寄主植物對根結線蟲抵抗力增強［34］。研究表明在顯微解剖的巨細胞中，觀察到細胞分裂素信號負調控因子普遍下調［35］。結合上述觀察，外源細胞分裂素的應用［36］表明在巨細胞的起始階段對細胞分裂素的需求是短暫的。

2.2.4 線蟲取食位點中赤霉素介導的調控途徑 番茄對植物寄生根結線蟲適應性反應轉錄譜的研究表明，在寄生過程中，編碼赤霉素（GA）2-氧化酶樣蛋白的基因轉錄上調［37］。GA2-氧化酶是參與赤霉素失活的酶，赤霉素失活是一個復雜和嚴格調控植物細胞伸長的過程。其基因轉錄的上調可以反映根結線蟲侵染期間活性赤霉素水平的降低，研究發現在孢囊線蟲與擬南芥的相互作用中，赤霉素氧化酶的誘導模式亦是如此［38］。因此，赤霉素調節的信號可能是植物對植物寄生線蟲的共同反應。此外，南方根結線蟲誘導的水稻根部巨細胞的轉錄分析表明［39］，與未感染線蟲細胞相比，巨細胞中下調幅度最大的基因為參與赤霉素分解代謝的赤霉素2-β雙加氧酶的轉錄本，而參與赤霉素降解的基因也因為控制赤霉素內部動態平衡的反饋效應而被誘導。

2.2.5 線蟲取食位點中多肽類激素介導的調控途徑 線蟲參與編碼和分泌植物多肽類激素。甜菜孢囊線蟲的SYV-46肽可能編碼了一個CLE樣配體［40］。SYV-46蛋白從SCN花柱分泌蛋白質［41］在寄生植物中起直接作用。SYV-46蛋白作為一個CLE不僅能與CLV2結合，而且還能夠與擬南芥CLV3-1突變體互補［42］。與大豆孢囊線蟲SYV-46蛋白一樣，南方根結線蟲16D10是一個未知蛋白，但序列分析表明其包含編碼CLE類分泌蛋白的功能區［43］，16D10的轉基因表達對根的發育有重要影響。對日本蓮藕的遺傳分析表明，CLV1類受體har-1在控制南方根結線蟲［44］形成的根結數量時起著重要作用［45］。

3 植物激素對線蟲取食位點建立與形成的 影響

由于植物激素在協調植物對寄主植物和寄生線蟲的反應中起著關鍵作用，植物寄生線蟲可以通過調節激素平衡來促進其高度專化的取食結構形成［46］。在植物寄生線蟲建立的取食位點中觀察到生長素、乙烯、細胞分裂素等激素信號的變化，這些植物激素信號變化是線蟲蟲癭完成發育和汲取營養所必須的。

3.1 植物生長素誘導分生組織中的細胞分裂

生長素（吲哚-3-乙酸）是一類植物次生代謝物，參與許多發育過程能夠誘導分生組織中的細胞分裂。生長素進入細胞依賴于質子泵，生長素的電子通量及其在各種組織中的分布是由PIN蛋白介導的。部分證據表明植物須根與線蟲取食位點發育過程具有相似性及分子水平的聯系，在植物須根的形成過程中PIN蛋白引起植物自身生長素水平增加［47］。在爪哇根結線蟲（M. javanica）和花生根結線蟲（M. arenaria）的根結中可以檢測到啟動子驅動GFP表達LBD16的基因，它能夠被生長素的阻抗劑PEO-IAA抑制，實驗結果表明根結中需要有定量的生長素才能使LBD16 表達［48］。在根結線蟲和孢囊線蟲中誘導表達的WRKY23是另一種受生長素調控的相關基因，在線蟲取食位點或須根形成過程中，WRKY23 在SLR/IAA14（生長素反應因子）- ARF7/ ARF19信號通路的下游起作用，參與須根發育過程中刺激局部的類黃酮生物合成［49］。與線蟲的分泌物激活LBD16的表達類似［50］，線蟲相關的信號調控WRKY23的表達在線蟲取食位點中通過獨立的生長素途徑激活。

3.2 乙烯促進取食位點形成

乙烯作為一種簡單的氣態化合物，可以在植物細胞應對生物或非生物脅迫時產生。當受到線蟲侵染時，植物根部細胞會產生乙烯，這是對生物脅迫的輔助反應［51］。乙烯過多突變株eto1、eto2和eto3導致孢囊線蟲感病性增加［29］，表明乙烯水平的增加促進了根部合胞體的發生。對乙烯相關的突變體功能分析進一步表明乙烯在植物與線蟲互作過程中的重要性：一方面乙烯過量表達的突變體eto2和eto3更加容易感染孢囊線蟲；另一方面，乙烯信號通路中的突變體tr1-1，ein2-1，ein3-1，eir1-1和axr2對孢囊線蟲的感病性降低［29］。研究表明乙烯合成及信號相關的基因如編碼膜受體的ACC氧化酶或ACC合成酶在取食位點中誘導表達［52］。組織學分析顯示，在取食結構的擴大和相鄰細胞間的合胞體細胞壁溶解增強的過程中乙烯起到主要作用［53］。

3.3 細胞分裂素促進分生組織中的細胞分化

細胞分裂素作為一類嘌呤類分子參與分生組織細胞分裂，通過對細胞周期的影響能夠促進分生組織中的細胞分化［54］。在細胞周期中，細胞分裂素可以在G1/S期轉變時起作用［55］。研究表明根結線蟲可以產生具有生物活性的細胞分裂素［56］。激光共聚焦分析表明水稻根結線蟲（M. graminicola）巨細胞調控生長素與細胞分裂素濃度平衡［57］。在巨細胞中，26%的生長素相關基因特異表達，而在合胞體中，21%的分裂素相關基因被誘導表達。相反，巨細胞中細胞分裂素相關基因被抑制的數量更多；而合胞體中分裂素上調的相關基因數量更多［58］。

3.4 赤霉素促進分生組織發育及成熟

赤霉素是細胞分裂和伸長的重要刺激因子，研究表明赤霉素通過影響雙子葉植物和單子葉植物葉片組織中的Della蛋白家族，在控制和協調細胞分裂、細胞擴張等方面發揮著重要作用［59］。與該研究類似的是，在番茄和水稻南方根結線蟲的巨細胞中及大豆孢囊線蟲形成的合胞體中，普遍增強了赤霉素合成或反應相關基因的表達水平［60］。赤霉素在刺激細胞分裂和伸長方面起著重要作用。在對水稻根結線蟲侵染引起的轉錄重組研究中發現，線蟲形成的根結中上調最強的基因是脂轉移蛋白（LTP）基因家族的赤霉素（GA）受體GID1L2，并有研究證明赤霉素（GA）受體GID1L2在巨細胞中被強烈誘導表達［61］。此外，Klink等［62］觀察到大豆孢囊線蟲 （H. glycines）合胞體中赤霉素生物合成基因的上調和赤霉素代謝相關基因的顯著激活，GA20-氧化酶1和2兩個關鍵的氧化酶催化赤霉素生物合成。這些觀察表明赤霉素在巨細胞的發育、維持和成熟過程中起著重要的作用。

3.5 多肽類激素阻礙植物細胞正常發育

多肽類激素在植物生長發育中起著重要作用，植物編碼大量的跨膜受體激酶，這些激酶能感知激素配體。研究發現南方根結線蟲16D10基因包含編碼CLE類的分泌蛋白序列，而16D10基因阻礙植物細胞正常發育。此外，在孢囊線蟲中也發現了與CLAVATA3/胚乳周圍區域相關的多肽（CLE）具有阻礙寄主植物生理的作用。目前已在大豆孢囊線蟲、甜菜孢囊線蟲、馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensi）中發現更多的CLE類基因［63］。通過對CLE類進行基因沉默或對基因沉默植株接種線蟲后進行功能分析，發現大豆或擬南介中線蟲侵染率下降，合胞體體積變?。?4］。綜上所述CLE類多肽在合胞體和巨細胞發育中起到抑制作用。

4 展望

植物激素通常起到活化劑或拮抗劑的作用，從而起到增強或抑制活性的效果。生長素的增加可能導致乙烯的產生，而細胞分裂素抑制生長素信號和運輸。最近對線蟲取食位點發育的高通量研究表明，各種激素介導的信號通路之間的相互作用導致激素相關基因的差異表達。植物激素在線蟲取食位點形成過程中通常是協同作用的，并在建立取食位點和將根細胞重組為專門的取食結構中起到關鍵調節作用。在大豆、番茄和擬南芥等不同植物中，生長素和乙烯等激素在孢囊線蟲合胞體形成中的作用相似。植物β-內葡聚糖酶啟動子中ABA和GA反應元件在合胞體發育過程中上調［65］，表明這兩種激素都可能參與調節細胞壁的改變。因此，可以推測植物激素在不同植物的根結線蟲巨細胞發育過程中具有相互調節作用，未來通過高通量轉錄組測序和功能研究，將有助于揭示巨細胞和合胞體發育過程中不同植物激素的調控作用。

除了傳統的植物激素外，新的激素如獨腳金內酯［66］、肽激素CLEs［67］、茉莉酸［68］和水楊酸在線蟲取食位點形成中的作用值得一提。近年來研究表明，獨角金內酯是生長素的長距離信使［69］，在根瘤菌結瘤過程中起著重要作用。而根瘤菌結瘤和線蟲取食位點發育有著相似的反應，并且存在重疊的信號通路。同樣我們推測獨腳金內酯在內寄生線蟲誘導的取食位點發育中也起著類似的作用。多肽類激素CLEs調節許多植物生長過程，包括器官形成、分生組織功能和遠程信號傳遞［70］，多以阻礙植物細胞正常發育進而介導形成取食位點發揮作用。大豆孢囊線蟲誘導合胞體的轉錄組基因表達分析表明，受生長素、乙烯、赤霉素、茉莉酸和細胞分裂素等一系列激素控制的基因表達存在差異［71］。水楊酸作為根結線蟲成功誘導或維持取食位點的重要激素在寄主植物生長發育中起重要作用，控制寄主植物對寄生線蟲的防御反應。最新研究表明，在線蟲侵染的不同時間段，水楊酸途徑的基因在擬南芥和水稻的巨細胞和根瘤中普遍受到抑制，而接種南方根結線蟲后水楊酸途徑的正調控因子NPR1的過表達導致寄主植物根瘤和卵塊的數量減少［72］。

對植物分子特征變化的研究是了解植物與線蟲互作的基礎，有助于充分了解正常的植物細胞如何重組形成取食位點的細胞，也有助于明確線蟲效應子在與其它植物激素互作中的功能，最終明確它們在干擾植物發育過程中的作用，從而為構建抗線蟲的植株、研究特殊的線蟲防治策略提供有力的技術支撐。