松材線蟲和擬松材線蟲雙重RPA檢測研究

方圓 吳迅 林宇 王海燕 吳慧平 鞠玉亮

（1. 安徽農業大學植物保護學院/植物病蟲害生物學與綠色防控安徽普通高校重點實驗室，合肥 230036；2. 天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300461）

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是一種遷移性內寄生植物線蟲，引起的松樹萎蔫病，被稱為松樹的“癌癥”［1］。松樹萎蔫病是松林最嚴重的病害，已對東亞松林資源和松林生態系統造成毀滅性破壞，造成巨大經濟損失［2-4］。我國于1982年首次在南京紫金山黑松上發現松材線蟲［5］，截至2018年，松材線蟲已擴散至我國18個省的588個縣級行政區域，累計致死松樹達數十億株，造成經濟損失超數十億元（國家林業和草原局2019年第4號公告）。傘滑刃屬包含100多個描述種，其中，松材線蟲與擬松材線蟲（B. mucronatus）的親緣關系最近［6］。擬松材線蟲與松材線蟲占據相同的生態位，兩者在形態、生活習性、傳播媒介、寄主等方面有許多相似的生物學特性［7］。傳統觀點認為擬松材線蟲不致病或致病力較弱，但近年來大量研究表明擬松材線蟲不同種群致病性存在明顯分化，增加了松材線蟲的檢測和防控難度［8-9］。

松材線蟲防控關鍵環節主要包括3個方面，即病害檢疫與疫情監測、疫木除治和媒介昆蟲防治，其中，病害檢疫的核心內容是松材線蟲的檢測鑒定［10］。傳統檢測方法主要依據松材線蟲的形態學特征，而松材線蟲與擬松材線蟲的形態特征極為相似，唯一不同點僅在于擬松材線蟲雌蟲尾端的尾尖突。然而，不同地理群體松材線蟲雌蟲尾尖突有較大變化，僅根據形態特征來判斷，往往是不可靠的，可能導致錯誤診斷［11］。近二十年來，以聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎的分子檢測技術在植物線蟲分子診斷方面應用廣泛［12-13］。常規PCR、PCR-RFLP、PCR-SCAR、雙重PCR、實時熒光定量PCR等技術已大量應用于松材線蟲和擬松材線蟲的快速、同步或定量檢測鑒定［14-18］。以PCR為基礎的分子技術為松材線蟲的檢疫鑒定提供成熟可靠的技術，同時也存在對儀器設備、實驗條件和實驗人員專業背景要求高的特點。

近年來，恒溫擴增技術在植物線蟲檢測方面受到越來越多的關注，其中，應用較多的主要為環介導恒溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA）。LAMP可在60-65℃條件下依靠3對引物完成對核酸的特異性擴增，已廣泛應用于松材線蟲、根結線蟲、短體線蟲、水稻干尖線蟲等的分子檢測［12，19-22］。RPA在30-42℃恒溫條件下，利用1對長約30-35 bp的RPA引物在重組酶、單鏈結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶3種酶的作用下完成對核酸的指數擴增。RPA技術已用于松材線蟲、根結線蟲、菊花滑刃線蟲的可視化快速檢測［23-27］。Cha等［24］首次將RPA技術應用于植物線蟲快速檢測，并結合SYBR green I紫外顯色法在30 min內實現對感病松木內松材線蟲的可視化快速檢測。

目前，尚未見雙重RPA技術在植物線蟲檢測鑒定方面的應用，本研究以松材線蟲和擬松材線蟲核糖體DNA（rDNA）內轉錄間隔區ITS（internal transcribed space）為檢測靶標，設計RPA引物，優化RPA檢測體系，建立可同步檢測松材線蟲和擬松材線蟲的雙重RPA檢測體系，為兩種線蟲的檢疫鑒定提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗供試15個線蟲種群見表1，其中，松材線蟲種群5個，擬松材線蟲種群4個，豆傘滑刃線蟲（B. doui）種群1個，食菌傘滑刃線蟲（B. fungivous）種群1個，萊奴爾夫滑刃線蟲（B. rainulfi）種群1個，菊花滑刃線蟲（Aphelenchoides ritzemabosi）種群1個，水稻干尖線蟲（A. besseyi）種群2個。所有線蟲種群都已進行形態學和分子鑒定，并由安徽農業大學植物線蟲實驗室保存。

表1 供試線蟲種群Table 1 Population information of nematodes

1.2 方法

1.2.1 單條線蟲DNA提取 單條線蟲DNA提取參考容萬韜等［28］的方法，體式顯微鏡下挑取單條線蟲，置于含8 μL ddH2O的載玻片中，用解剖針將線蟲切斷，加入2 μL裂解液，于56℃溫育1 h，95℃處理10 min，離心取上清于-20℃保存備用。

1.2.2 雙重RPA引物設計 RPA引物設計原則要求引物長30-35 bp，3'端富含GC，5'端含有嘧啶，擴增片段小于500 bp。依據www.twistdx.co.uk提供的RPA引物設計建議，對松材線蟲和擬松材線蟲ITS區差異序列進行分析，并對趙立榮等［14］所開發PCR引物進行改造，設計雙重RPA引物Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R（表2）。其中引物對Bx-rpa-F/Bxm-rpa-R用于檢測松材線蟲，Bm-rpa-F/Bxmrpa-R用于鑒定擬松材線蟲，兩者共用下游引物Bxm-rpa-R。RPA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 用于雙重RPA的引物及其序列Table 2 Primers and their sequences for duplex-RPA

1.2.3 雙重RPA擴增 RPA擴增反應參照TwistAmp Basic Kit（TwistDx Limited，Cambridge，UK）操作說明進行，RPA擴增體系為50 μL。將2.4 μL PRA引物（10 μmol/L），2 μL模板DNA，29.5 μL TwistAmp rehydration buffer，11.2 μL ddH2O于反應管中充分混勻。加入2.5 μL MgAc（280 nmol/L）啟動RPA反應，于37℃水浴30 min。反應結束后，用SanPrep PCR純化試劑盒（Sangon Biotech，China）純化RPA產物，并在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.2.4 雙重RPA反應條件優化 為確定雙重RPA的最佳反應條件，對反應體系中RPA引物濃度配比進行優化。在50 μL反應體系中，松材線蟲和擬松材線蟲DNA提取液按1∶1配比作為模板，設置不同引物濃度配比進行RPA反應，即10 μmol/L引物Bx-rpa-F、Bm-rpa-F、Bxm-rpa-R分別按2.4∶0∶2.4、2.1∶0.3∶2.4、1.8∶0.6∶2.4、1.5∶0.9∶2.4、1.2∶1.2∶2.4、0.9∶1.5∶2.4、0.6∶1.8∶2.4、0.3∶2.1∶2.4、0∶2.4∶2.4 μL的量添加。

1.2.5 常規PCR檢測 常規PCR反應體系為25 μL，具體為1 μL模板DNA，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，12.5 μL×TaqPCR MasterMix，ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。1.2.6 雙重RPA特異性和靈敏度分析 選取表1所列15個線蟲種群，提取單條線蟲DNA，檢測Bxrpa-F、Bm-rpa-F、Bxm-rpa-R用于松材線蟲與擬松材線蟲雙重RPA檢測的特異性。同時，以ddH2O為陰性對照，試驗重復3次。分別制備松材線蟲和擬松材線蟲大量線蟲DNA提取液和單條線蟲DNA提取液進行雙重RPA靈敏度檢測。單條線蟲DNA稀釋至20 μL，分別取2 μL（即初始濃度為1/10條線蟲DNA），按10倍梯度稀釋法分別稀釋101、102、103、104、105倍。取2 μL稀釋液分別進行RPA擴增，檢測Bx-rpa-F/Bm-rpa-F/Bxm-rpa-R對松材線蟲和擬松材線蟲的檢測靈敏度。此外，取相同稀釋液進行PCR擴增反應，比較RPA與PCR的檢測靈敏度。

1.2.7 雙重RPA鑒定松木樣品中松材線蟲與擬松材線蟲 為測試雙重RPA的實用性，分離采集自安徽省松材線蟲疫區的9份松木樣品中的線蟲進行雙重RPA檢測（表3）。松木樣品中線蟲DNA的提取參考Kikuchi等［12］的方法，DNA提取液用ddH2O稀釋至100 ng/μL，在-20℃保存備用。此外，通過鏡檢的方法確認并鑒定松木樣品中松材線蟲與擬松材線蟲。

表3 松木樣本中松材線蟲與擬松材線蟲的雙重RPA檢測Table 3 Duplex-RPA detection for B. xylophilus and B. mucronatus

2 結果

2.1 RPA檢測方法的建立

在本研究中，通過對松材線蟲和擬松材線蟲的ITS序列進行差異分析，分別設計松材線蟲和擬松材線蟲特異性上游引物Bx-rpa-F和Bm-rpa-F，以及兩者共同下游引物Bxm-rpa-R。通過減少引物數量的方式提高引物擴增效率，避免非特異性擴增片段的產生。以Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R為引物進行RPA反應，對松材線蟲DNA的擴增產物為364 bp，對擬松材線蟲DNA的擴增產物為189 bp，對松材線蟲和擬松材線蟲DNA等量混合物的擴增產物為364 bp、189 bp，陰性對照未檢測到擴增條帶，表明Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R可用于松材線蟲和擬松材線蟲的雙重RPA檢測（圖1）。

圖1 松材線蟲和擬松材線蟲雙重RPA檢測Fig. 1 Duplex-RPA assay for detecting B. xylophilus and B. mucronatus

2.2 RPA引物最佳濃度配比

松材線蟲和擬松材線蟲等量混合物作為模板，設 置Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R不 同 引 物濃度配比進行雙重RPA擴增。結果（圖2）發現，RPA引物Bx-rpa-F和Bxm-rpa-R僅能從混合DNA樣本中檢測到松材線蟲，而Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R僅能從混合DNA樣本中檢測到擬松材線蟲。Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R三條引物組合可同時檢測到松材線蟲和擬松材線蟲，但不同引物配比間的擴增效果差異明顯，當三者添加量為1.5∶0.9∶2.4 μL 時，雙重RPA擴增效果最佳。

圖2 不同引物配比下的擴增產物Fig.2 Amplified products with different primer ratios

2.3 雙重RPA特異性檢測

利用本研究建立的雙重RPA檢測體系，分別對15個不同線蟲種群的DNA進行PCR擴增。結果如圖3所示，5個松材線蟲種群均擴增出364 bp的特異性條帶，4個擬松材線蟲種群均擴增到189 bp條帶，而其它6個線蟲種群及陰性對照均無擴增，表明以Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R為基礎的雙重RPA檢測具有較好的特異性。

圖3 雙重RPA特異性檢測Fig.3 Specificity test of duplex-RPA

2.4 雙重RPA靈敏度檢測

以Bx-rpa-F、Bm-rpa-F和Bxm-rpa-R（添 加 量1.5∶0.9∶2.4 μL）為引物組合，分別以松材線蟲和擬松材線蟲大量線蟲DNA提取液和單條線蟲DNA提取液為模板進行雙重RPA靈敏度檢測。將松材線蟲和擬松材線蟲初始濃度為1/10條線蟲的DNA模板，按10倍梯度稀釋后進行雙重RPA檢測。當松材線蟲模板稀釋10倍時，能檢測到RPA擴增條帶，而PCR在模板稀釋100倍時仍能檢測到目的條帶，表明雙重RPA檢測對松材線蟲的檢測靈敏度為10 pg/μL，相當于1/100條線蟲（圖4-A）；當擬松材線蟲模板稀釋10倍時，未檢測到擴增條帶，而PCR在模板稀釋100倍時仍有特異性擴增，表明雙重RPA對擬松材線蟲的檢測靈敏度為100 pg/μL，相當于1/10條線蟲（圖4-B）。同時，松材線蟲與擬松材線蟲稀釋液等比例混合作為模板時，雙重RPA檢測靈敏度與兩種線蟲單獨作為模板時一致（圖4-C）。此外，通過與常規PCR檢測靈敏度比較發現，常規PCR對松材線蟲和擬松材線蟲的檢測靈敏度為1/1 000條線蟲，高于RPA檢測靈敏度。

圖4 雙重RPA靈敏度檢測Fig. 4 Sensitivity test of duplex-RPA

2.5 松木樣本中松材線蟲和擬松材線蟲的雙重RPA檢測

采集安徽省松材線蟲疫區的9份松木樣品，利用本研究建立的雙重RPA檢測體系對其中的松材線蟲和擬松材線蟲進行檢測鑒定。結果如圖5所示，采集自南陵地區的3份松木中2份攜帶松材線蟲、1份同時攜帶松材線蟲和擬松材線蟲；滁州地區1份松木攜帶松材線蟲、2份松木同時攜帶松材線蟲和擬松材線蟲；桐城地區的3份樣品僅攜帶松材線蟲或擬松材線蟲。雙重RPA檢測結果與鏡檢結果一致，表明雙重RPA可用于松木樣本中松材線蟲和擬松材線蟲的同步檢測。

圖5 松木樣品中松材線蟲和擬松材線蟲雙重RPA檢測Fig.5 Duplex-RPA assay for detecting B. xylophilus and B. mucronatus from wood samples

3 討論

近年來，松樹萎蔫病發生呈現新趨勢：向西、向北快速擴散態勢，最西端達四川省涼山州，最北端已在遼寧北部多個縣區，發生區域突破了傳統理論提出的松材線蟲年均氣溫10℃以上的適生界線；發現云杉花墨天牛等新的傳播媒介；危害對象由過去的馬尾松、黑松擴大到紅松、落葉松等松樹種類［29-31］。此外，松樹萎蔫病已逼近三峽庫區、秦巴山、廬山、黃山等生態區或國家重點風景名勝區，嚴重威脅其生態安全，防控任務十分緊迫。在自然條件下，擬松材線蟲往往與松材線蟲同時發生，且兩者形態和生物學習性近似，為松材線蟲的檢疫鑒定增加難度。

Cha等［24］針對松材線蟲5S rDNA序列設計引物，建立松材線蟲RPA恒溫擴增體系，該體系可在10 min內完成對核酸的指數擴增，檢測靈敏度為1.6 pg松材線蟲基因組DNA，檢測效率較常規PCR和LAMP技術極大提高，但仍無法滿足對松材線蟲和擬松材線蟲同步檢測的需求。本研究以松材線蟲和擬松材線蟲ITS序列為靶標，設計雙重RPA引物，可在37℃恒溫條件下30 min內完成對靶標核酸的特異性擴增，可實現松材線蟲和擬松材線蟲的同步快速檢測。

在特異性方面，本研究參考趙立榮等［14］的引物設計策略，開發松材線蟲特異性上游引物Bxrpa-F、擬松材線蟲特異性上游引物Bm-rpa-F和兩者同用下游引物Bxm-rpa-R，在一個雙重RPA反應中添加3條引物，降低非特異性擴增和引物二聚體的幾率。同時，通過3條引物的最佳濃度配比優化，確定雙重RPA反應中Bx-rpa-F/Bm-rpa-F/Bxm-rpa-R的添加比例為5∶3∶8時，雙重RPA擴增效果最佳。在靈敏度方面，雙重RPA對松材線蟲和擬松材線蟲的檢測靈敏度分別為1/100、1/10條線蟲，低于常規PCR的1/1 000條線蟲，且低于已報道的LAMP 2.5×10-5條松材線蟲的檢測靈敏度［12］。雙重RPA檢測靈敏度雖低于常規PCR技術，但其足以檢測單條松材線蟲和擬松材線蟲，滿足對兩種線蟲快速檢測的需求。在實用性方面，雙重RPA從松木樣品線蟲DNA提取液中同步檢測到松材線蟲和擬松材線蟲，且擺脫PCR儀的限制，拓寬應用場景。

4 結論

本研究建立的雙重RPA檢測方法操作簡便、檢測效率高、特異性強、靈敏度高、對儀器設備要求低，能夠實現對松材線蟲和擬松材線蟲的同步檢測，此方法可滿足檢疫部門或基層部門對松材線蟲和擬松材線蟲檢疫鑒定的需求。