不同基因型腐爛莖線蟲群體雜交后代分子特征比較

倪春輝 李惠霞 李文豪 劉永剛 徐雪芬 韓變

（1. 甘肅農業大學植物保護學院 甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070；2. 甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州 730070）

腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）廣泛分布于溫帶地區：北美、歐洲、地中海（局部）、亞洲（局部），大洋洲、非洲也有少量報道，目前在中國、美國、加拿大、法國、德國和日本等25個國家均有發生和危害［1-2］。在我國，該線蟲嚴重危害甘薯［3］、馬鈴薯［4-5］和當歸［6］等作物，是農業上重要的一種檢疫性線蟲［7］。研究表明，腐爛莖線蟲種內分化嚴重，不同來源的腐爛莖線蟲在基因序列、耐寒性、致病性與形態特征等方面都存在差異，從不同寄主分離的群體雖存在致病力差異，尚不能劃分出生理小種［8］。林茂松等［9］發現鹽灘地區甘薯中分離的群體耐鹽性明顯高于低鹽的內陸地區。王宏寶等［10］發現不同地理來源群體耐寒性有很大差異，部分群體可在零下70℃存活180多天。丁中等［11］發現河北地區腐爛莖線蟲群體對不同藥劑的抗藥性存在差異，抗藥性強的群體對涕滅威的抗性是敏感群體的3-4倍。王宏寶等［8］通過綜合分析，提出腐爛莖線蟲很可能是一個正處于快速進化過程中的復合種，或者為種內不同生物型，或者是復合種下不同生物型。目前，該線蟲主要以ITS-rDNA序列差異來區分不同的基因型，對于致病型或生理小種的劃分尚缺乏足夠的科學依據。

宛菲等［12］發現我國甘薯腐爛莖線蟲群體核糖體DNA的ITS區序列存在明顯差異，可以劃分為A型和B型兩類；于海英等［13］發現在23個群體中，雖然A、B兩個類型ITS區序列差異較大，但28S rDNA D2/D3區序列片段長度一致，序列相似度達99%，差異較小。章淑玲等［14］研究發現腐爛莖線蟲ITS1-rDNA序列存在長（L）和短（S）兩種不同類型，長度差異與上述A、B類型相同，且差異主要表現在ITS1區。2011年，Subbotin等［15］研究指出，已報道的腐爛莖線蟲ITS-rDNA序列具有5種長度差異，且ITS1二級結構差異主要出現在H9螺旋區域。根據H9螺旋結構的有無及其差異，將70多個群體劃分為A-G 7個基因型。

腐爛莖線蟲種內存在明顯的分化現象，本研究基于Subbotin等［15］基因型分化的研究，擬對腐爛莖線蟲不同基因型群體進行雜交，探索群體間是否存在生殖隔離，群體之間基因交流是否會引發后代遺傳變異，以期為該線蟲群體分化及致病性變異機制的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試線蟲來源于馬鈴薯、當歸和黨參等寄主，采集自甘肅、黑龍江等地，詳細信息見表1。來源于當歸群體MXA2和來源于黨參群體WYA4的ITS二級結構中H9螺旋結構與Subbotin等［15］總結的存在差異，當歸群體ZXA1雖不具有H9螺旋結構，但與A基因型ITS1區H7/H8螺旋結構存在差異，此3個群體均不能歸于A-G 7個基因型，暫定為N、H和K基因型。線蟲繁殖采用以茄鐮孢（Fusarium solani）平板培養物為載體和營養來源。

表1 供試腐爛莖線蟲群體信息 Table 1 Population information of D. destructor

1.2 方法

1.2.1 腐爛莖線蟲不同群體雜交組合 參照王宏寶等［16］和Webster［17］的方法，在長滿菌絲的PDA斜面滴一滴無菌水（約5 μL），用自制挑針挑取1條3-4齡幼蟲（母本）與另外一群體的5條雄蟲（父本），置于水滴中，輕輕放置于培養箱中培養。每個處理重復20管。以群體DXP1自交為對照，試驗雜交組合見表2。25℃下黑暗培養60 d后，采用改良貝曼漏斗法分離線蟲，統計線蟲數量，若線蟲數量≤6條（親本數量），則排除1條雌蟲和全為雄蟲（不統計），只統計幼蟲或者≥2條雌蟲。

表2 腐爛莖線蟲群體雜交組合Table 2 Population hybrids combinations of D. destructor

1.2.2 ITS區PCR擴增與測序 線蟲DNA提取參照王江嶺等［18］方法略有改動。取單條線蟲于無菌水中清洗3次，挑入裝有10 μL WLB的200 μL PCR反應管中，離心后浸入液氮1 min，85℃水浴2 min，重復2次，隨后加入1 μL蛋白酶K（1 mg/mL），于PCR儀中65℃溫育1 h，95℃下10 min使蛋白酶K失活，以14 000 r/min離心5 min，最后于4℃保存備用。

采用線蟲ITS區通用引物18S：5'-TTGATTAC- GTCCCTGCCC TTT-3'、26S：5'-TTTCACTCGCCGT- TACTAAGG-3'［19］與TW81：5'-GTTTCCGTAGGTG- AACCTGC-3'、AB28：5'-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3'［20］，對線蟲ITS-rDNA基因進行PCR擴增。反應采用25 μL體系：上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×San Taq Fast PCR Master Mix（with Blue Dye）12.5 μL（上 海 生 工），DNA模 板3 μL，ddH2O 7.5 μL。擴增程序：94℃ 4 min，94℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 15 s，38個循環，72℃延伸5 min后于4℃保存備用。擴增產物經電泳檢測后送往北京擎科西安分公司測序，使用軟件SeqMan拼接測得的序列。

1.2.3 ITS-rDNA序列比對分析 使用軟件BioEdit對引物18S/26S與TW81/AB28擴增測序得到序列的進行比對，修正并統計引物TW81/AB28擴增產物的長度。并用軟件ClustalX比對分析親本和F1代序列。參 照Subbotin等［15］方 法，用 在 線 軟 件Mfold［21］（http：//www.unafold. org/mfold/applications/rnafoldingform.php）預測親本和雜交后代ITS-rDNA序列的RNA二級結構，并用Varna［22］與Photoshop cc2018對結構進行美化與注釋，使用軟件BioEdit比對H9結構序列。

1.2.4 ITS-RFLP 參考Subbotin等［15］方法，采用DdeI、Hinf I、Tru9 I（MseI）、SduI 4種 內 切 酶，使用在線軟件Wbcuter 2.0（http：//www.firstmarket.com/cutter/cut2.html）分析所得序列。

1.2.5 ITS-rDNA序列系統發育分析 參照Subbtion等［15］的方法，以BI法構建系統發育樹。具體方法如下，用MAFFT軟件比對分析后，用DAMBE檢測飽和度，用軟件MrMTgui連接PAUP與MrModelTest進行模型選擇，最后使用Mrbayes以最佳模型構建系統發育樹，用FigTree美化發育樹。

2 結果

2.1 不同來源腐爛莖線蟲雜交結果

不同來源腐爛莖線蟲群體11個組合生物學雜交結果顯示，群體內自交處理（DXP1×DXP1）顯著大于其他處理。基因型內雜交（TCC1×DXP1）與其他雜交處理無顯著差異，不同基因型群體雜交9個組合的F1代數量普遍較少。每個處理的20個重復中，只有少數重復發現F1代，且線蟲數量較少。B型群體DXP1自交F1代為18條/處理，其他處理線蟲數量均≤6條/處理，略小于自交處理。部分處理（WYA4×DXP1；HLJP1×DXP1；MXA2×DPX2；MXA2×DPX2；DXP2×MXA2）僅發現1條/處理（表3）。

表3 腐爛莖線蟲群體生物學雜交結果Table 3 Biological hybridization results of D. destructor from different sources

2.2 腐爛莖線蟲雜交后代及親本群體ITS-rDNA序列比對分析

F1代數量較少，采用單條線蟲提取DNA，由于測序成功率較低，獲得5個雜交組合（DXP1×DXP1；MXA2×ZXA1；DXP2×DXP1；DXP1×DXP2；TCC1×DXP1）F1代ITS-rDNA序 列，長 度 均 為915 bp（表4）。B型自交（DXP1×DXP1）F1與親本序列相同，B型群體間雜交（TCC1×DXP1）F1與親本也無堿基差異。其他組合的F1代均與親本序列不同，差異主要表現在ITS1區。其中處理MXA2×ZXA1的F1代與親本差異最大，其親本序列相差164 bp，F1與父本MXA2（N型）序列堿基差異為38 bp，與母本ZXA1（H型）序列堿基差異為83 bp。雜交組合DXP2×DXP1、DXP1×DXP2后代與其親本DXP2（C型）相差24個堿基，與其親本DXP1（B型）相差1個堿基。結果表明親本間堿基數差異越大后代群體變異越大，后代與親本的堿基數差異越大。

表4 不同來源腐爛莖線蟲雜交后代序列比對結果Table 4 Sequence alignment results of hybrid progeny of D. destructor from different sources

親本與后代ITS1區RNA二級結構預測結果（圖1）表明，ITS1二級結構比較保守，結構大致相同，差異主要表現在螺旋H9區。對螺旋H9結構和序列（圖2）比對發現，群體MXA2×ZXA1雜交后代與親本差異最大。F1代與親本H9結構和序列均存在差異，其父本MXA2（N型）具有H9結構，母本ZXA1（H型）不具有該結構，其后代結構與DXP1（B型）相似，二者H9序列只差1個堿基。群體DXP1×DXP1、TCC1×DXP1與親 本H9結構和序列均無差異；DXP2×DXP1、DXP1×DXP2結構與DXP2（C型）相似，序列僅僅相差一個堿基。序列比對還發現有些F1代出現了新的變異，部分堿基序列與父本和母本的都不同。

圖1 不同來源腐爛莖線蟲雜交后代與親本ITS1二級結構Fig. 1 Putative secondary structures of the ITS1 hybrid progeny and parental for D. destructoer with different origin

圖2 腐爛莖線蟲雜交后代與親本ITS1螺旋H9結構差異與序列比對Fig. 2 Variations and alignment of helix H9 of ITS1 between hybrid progeny and parental of D. destructor

2.3 腐爛莖線蟲雜交后代及親本群體核糖體ITSRFLP分析

腐爛莖線蟲親本和雜交后代酶切結果見表5。結果表明，供試群體序列差異主要為長度不同。供試群體可以歸為兩類，Ⅰ類包括MXA2×ZXA1、TCC1×DXP1、DXP1×DXP1和DXP1， 其 中TCC1×DXP1和DXP1酶切片段數量和長度完全一致，MXA2×ZXA1與其他兩個組合片段數量相同，長度存在微小差異。Ⅱ類包括DXP2×DXP1、DXP1×DXP2、ZXA1、MXA2、DXP2，這些群體酶切片段數量相同，DXP2×DXP1、DXP1×DXP2和DXP2片段長度相同，與ZXA1和MXA2片段長度均有差異。這兩類差異主要為內切酶SduI、Tru9I （MseI）酶切片段數量差異，Tru9I（MseI）將供試線蟲序列I類群體酶切為5個片段，將II類群體酶切為4個片段；SduI將I類群體酶切為4個片段，將II類群體酶切為3個片段。

表5 腐爛莖線蟲親本和F1代酶切結果 Table 5 Parental and F1 enzyme digestion results of D. destructor

2.4 腐爛莖線蟲雜交后代及親本群體ITS-rDNA系統發育分析

以食菌莖線蟲為外群，采用BI法對測得的親本與雜交后代共9個群體ITS序列構建系統發育樹（圖3）。9個群體可以分為兩支，DXP2、DXP1×DXP2和DXP2×DXP1聚為一支，親緣關系較近，其中DXP2與兩個F1代群體間存在一定的距離。MXA2、ZXA1、MXA2×ZXA1、TCC1×DXP1和DXP1（DXP1×DXP1）聚為一支，親緣關系較近，其中MXA2和ZXA1與其他群體存在一定的遺傳距離。4個不同來源群體雜交后代中MXA2×ZXA1的F1代、TCC1×DXP1的F1代與親本聚在一起，DXP1×DXP2的F1代、DXP2×DXP1的F1代 與 親本一方聚在一起。

圖3 基于腐爛莖線蟲ITS-rDNA序列F1和親本的貝葉斯系統發育樹，最佳模型為GTR+GFig. 3 Phylogenetic tree from Bayesian analysis generated from the ITS-rRNA gene sequence dataset for D. destructor parental and F1 using the GTR+G model

3 討論

關于不同來源腐爛莖線蟲生物學雜交研究報道較少，國內只有王宏寶等［16，23-24］開展了相關研究。王宏寶等［16］選用2個不同地理來源的甘薯群體，通過薯片平板雜交、薯條離心管雜交和薯塊切片打孔雜交等3種方法的對比發現，薯塊切片打孔雜交法優于其他方法，平均后代數為14.33條/皿，20個處理中有6個處理發現F1代。本試驗中，在線蟲培養過程中，發現來源于當歸和黨參的腐爛莖線蟲群體在甘薯很難繁殖，但所有群體均可在真菌上繁殖，故本試驗采用茄鐮孢菌為載體和營養來源，選取1條幼蟲與5條雄蟲進行雜交，以確保F1為雜交后代。由于受到試驗操作、線蟲自身情況以及線蟲活力等因素的制約，不同親本雜交后代數均比較少。本研究基因型內自交（DXP1）后代數量多于王宏寶等［16］結果，但雜交后代數量除TCC1×DXP1（103條/處理）較多外，其他群體均較少，推測可能是所用線蟲群體差異較大所致。

Nei和Kumar等［25］研究表明，空間隔離、自然選擇、基因漂變和交配機會等因子會促進種群內遺傳分化，增加亞種間的遺傳變異。不同地理群體間的空間隔離和基因流動的程度影響生殖隔離、遺傳變異和物種形成的潛力［26-27］。黃文坤等［27］發現，腐爛莖線蟲群體的遺傳距離與地理距離呈正相關，遺傳距離隨著地理距離的增大而增大。所以，空間隔離對基因交流具有一定的阻礙作用，降低或者阻斷基因交流，增強群體近緣交配程度，從而加速了種群內亞居群間的遺傳分化。王宏寶等［16，23］對國內來源于甘薯的A（短）和B（長）兩類基因型群體進行雜交，發現基因型內群體均能雜交成功，基因型間部分群體存在生殖隔離。酶切結果表明，雜交F1代ITS序列與親本存在差異，并且發現同一基因型內雜交后代繁殖力和致病力與自交后代存在差異，少數雜交后代致病力和繁殖力大于自交后代，但大多數群體致病力和繁殖力小于對照［24］。

本研究基于Subbotin等［15］的基因型分類，將一些不屬于A-G基因型的群體（MXA2、ZXA1和WYA4）與B基因型、C基因型進行雜交，發現B、C基因型正反交后代均接近于C基因型，N（父本）和H（母本）雜交后代與B基因較近，同一基因型內雜交后代無變異。表明不同基因型間群體雜交會產生變異，所有群體變異區域均出現在H9螺旋結構，這與Subbotin等［15］的結果一致，且雜交后代可能會產生不同于親本的基因型。由于后代數量較少，未能對其雜交后代的形態、繁殖力和致病力變化進行分析，雜交后代基因型變化是否與其它生物學表型相關尚有待進一步探究。

本研究發現腐爛莖線蟲雜交F1代數量較少，但未發現生殖隔離，表明不同來源腐爛莖線蟲因空間隔離而使群體間親和度較低。不同基因型雜交后代與親本ITS序列出現差異，推斷群體間的基因交流會加大后代變異程度，從而產生新的基因型群體。腐爛莖線蟲種內分化明顯，雖然本研究尚未證明基因變化與致病性相關，但王宏寶等［24］研究表明，群體雜交可能產生強致病力的群體。因此，需要加強腐爛莖線蟲的檢疫，以減少群體間的基因流動。

4 結論

本研究采用1條幼蟲與5條雄蟲組合進行雜交。結果表明，產生F1代數量普遍較少，B型群體TCC1（父本）和DXP1（母本）雜交后F1代數量為103條/處理，顯著大于其他處理。B型群體DXP1自交F1數量為18條/處理，其他F1代線蟲數量均≤6條/處理。由于后代數量較少，11個F1代中，只獲得5個群體的ITS-rDNA序列，發現同一基因型內雜交和自交所得F1代ITS-rDNA序列與親本無差異，不同基因型雜交所得F1代與其親本ITSrDNA序列均存在差異。不同基因型群體間雖親和度低，產生的F1代數量較少，但未發現生殖隔離。雜交后代的遺傳變異主要出現在ITS1區H9螺旋區域，并且親本之間差異越大，其后代與親本之間差異也越大。