植物源與微生物源生物制劑復配防治根結線蟲病

舒潔 張仁軍 梁應沖 陳雅瓊 張娟 郭建 陳穗云

（1. 云南大學生命科學學院，昆明 650091；2. 云南省作物病害生物防控技術研究中心，昆明 650091；3. 云南省煙草公司昆明市公司，昆明 650051；4. 峨山彝族自治縣化念鎮農業農村綜合服務中心，玉溪 653202；5. 云南省煙草公司紅河州公司，彌勒 652399；6. 云南大學生態與環境學院，昆明 650091）

番茄（Solanum lycopersicum）是全球重要經濟作物，全世界年產量達1.7 億t［1］。隨著我國番茄種植面積逐漸擴大，番茄根結線蟲（Meloidogyrnespp.）病、青枯病、早疫病等病害日趨嚴重［2-3］，尤其根結線蟲病在國內番茄種植區中普遍發生［4-5］。根結線蟲是一種能侵染多種農作物的雜食性植物病原蟲［4］，通過在寄主植物根部細胞間隙運動使侵染部位形成大小不一的瘤狀凸起，輕發時植株表現為營養不良、生長緩慢，病重時植株停止生長甚至萎蔫死亡，常見寄主植物如番茄、煙草（Nicotiana tabacum）等茄科作物［4］。目前針對根結線蟲的傳統防治方法有農業防治、化學防治。農業防治如深耕、輪作、培育抗性品種等［5-6］，但由于根結線蟲寄主范圍十分廣泛，且國內缺乏高抗作物品種，農業防治的效果并不理想［6］。化學防治是防治田間根結線蟲病的常用手段之一，由于使植物帶有農殘、對環境造成污染，讓線蟲產生耐藥性等負面效應無法消除，如“克百威”、“滅線磷”等化學藥劑已陸續被禁止使用［7］。因此，近年來的研究焦點已經放在尋找安全、環保、高效的新防治方法上，如生物防治、基因工程等。

生物防治是利用植物或微生物，通過在土壤中添加植株提取液、微生物發酵液等方式達到防治線蟲的目的［8-9］。用天然植物材料防治線蟲的作用機理是通過抑制線蟲抗氧化酶系活性、影響其神經系統興奮傳導、損傷線蟲體壁和消化道等方式［9-10］。目前約有300 余種植物被研究報道具有殺線蟲或使線蟲致病活性，如用于防治南方根結線蟲（Meloidogyne incongnita）的千里光（Senecio scandens）；防治爪哇根結線蟲（Meloidogyne javanica）的印楝（Azadirachta indica）等［10］。Kazuhiko等人首次發現苦參（Sophora flavescens）中提取的苦參堿具有殺線蟲活性［11-12］，但其殺蟲作用具體靶點尚未探明［13］。印楝素因其具有廣譜殺蟲活性且對環境低污染的優點被廣泛研究，作用機制為胃毒、觸殺等，是一種較為環保安全的植物源農藥［14-15］。我國利用植物源農藥防治線蟲的研究起步較晚，尚未找出致死線蟲的關鍵因子。加之植物源活性物質在土壤中易降解，其應用效果不穩定的問題有待研究［16-19］。除植物源殺線劑外，微生物源制劑對根結線蟲的防治也有報道。Dong等［20］研究發現淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）殺線蟲的重要機制是分泌幾丁質酶破壞蟲體壁和卵囊壁，近年來在煙草（Nicotiana tabacum）［21］、番茄［22］、黃瓜（Cucumis sativus）［23］等作物上均有生防應用實例。穿刺巴氏桿菌（Pasteurria penetrans）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）通過侵染并寄生于根結線蟲體內，通過分泌代謝產物對根結線蟲J2產生毒性作用［24-27］。但是單一微生物菌劑仍然受到土壤環境條件的制約，在應用中防治效果穩定性不佳［28］。

本研究中旨在以生物防治的理念為出發點，通過分離土壤微生物篩選出抑殺根結線蟲的生防菌，再將初篩有效抑殺根結線蟲的生防菌發酵液和植物源殺線劑進行拮抗試驗，以篩選出一種更高效的復配制劑防治根結線蟲的方案。經盆栽實驗初步驗證復配制劑對根結線蟲的防治效果，試圖探索出適應綠色農業生產需求的一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

南方根結線蟲（M. incongnita）來源為云南省玉溪市峨山縣番茄病根；供試菌株SJ5（Pseudomonas psychrotolerans）、SJ17（Chryseobacterium gleum）、SJ19（Bacillus subtilis）從云南省昆明市番茄地土壤中分離，由本實驗室保存；使用番茄品種為美的1號番茄，由云南省玉溪市峨山縣化念鎮番茄種植合作社惠贈；盆栽土壤為泥炭基質土。

供試藥劑為41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑（拜耳公司北京分公司），20%噻唑膦水乳劑（山東大農藥業有限公司），1%苦參印楝素乳油劑（云南綠戎生物產業開發股份有限公司），SJ5、SJ17、SJ19液體菌劑（云南大學發酵，有效活菌數≥3.0 億個/mL）。試驗在云南大學溫室大棚于2020 年10 月-2021 年1 月進行。

1.2 方法

1.2.1 根結線蟲J2的毒力測定 測試菌種接種于200 mL LB液體培養基（pH 7.4），于28℃，140 r/min進行48 h震蕩培養，得到生防菌發酵液，低溫條件下6 500 r/min離心3 min后，上清液經無菌濾膜（0.22 μm）除菌獲得發酵上清濾液。設置5個處理，每處理5 個皿（直徑35 mm），每皿20 uL根結線蟲J2懸液（約100 條），每皿添加100 μg/mL利福平，20 μg/mL青霉素，50 μg/mL鏈霉素；超凈工作臺中放置12 h后統計校正死亡率，重復3次。

處理1：3 000 μL對照LB液體培養基；處理2：3 000 μL SJ5發酵濾液；處理3：3 000 μL SJ17發酵濾液；處理4：3 000 μL SJ19發酵濾液；處理5：3 000 μL苦參印楝素稀釋液（1000 倍）；

校正死亡率=（處理組致死率-對照組致死率）/（1-對照組致死率）×100%。

1.2.2 生防菌的分子生物學鑒定 提取生防菌基因組DNA，經PCR擴增16S rRNA基因并測序（北京擎科生物科技有限公司昆明分公司）。測序得到的序列在NCBI Blast中進行對比，于數據庫（GenBank）中檢索下載近源菌株序列，利用MEGAX軟件進行菌株系統發育分析，用鄰接法（neighbour-joining）構建系統發育樹，檢驗自舉支持率（Bootstrap）重復抽樣次數為1 000，根據構建的系統發育樹鑒定菌種。

1.2.3 拮抗測試 LB培養基滅菌降溫至50℃后加入稀釋1 000 倍的1%苦參印楝素，倒板靜置。調節生防細菌菌懸液濃度為5×106CFU/mL，吸取50 μL均勻涂布在平板，再分別吸取5 μL另外兩株生防菌懸液點板，封膜后置于28℃恒溫箱倒置培養24 h，觀察有無抑菌圈產生，有抑菌圈代表菌株不能共同生長，無抑菌圈表示兩菌株相容，能共同生長。

1.2.4 盆栽試驗 選擇對根結線蟲易感病的番茄作為盆栽材料，盆栽土使用泥炭基質土，用30 d苗齡的番茄苗進行盆栽試驗，番茄苗移栽3 d后，設置7個處理，每個處理5盆，試驗重復3次。

CK0：不接種線蟲，不施用任何殺線蟲藥劑的陰性對照；CK1：每盆接種根結線蟲3 000 條，不施用任何殺線蟲藥劑的陽性對照；T1：每盆接種根結線蟲3 000 條，施用200 mL氟吡菌酰胺稀釋液（1 000 倍）；T2：每盆接種根結線蟲3 000 條，施用200 mL噻唑膦稀釋液（1 000 倍）；T3：每盆接種根結線蟲3 000 條，施用200 mL苦參印楝素稀釋液（1 000 倍）；T4：每盆接種根結線蟲3 000 條，各施用20 mL三種液體菌劑，15 d后重復1次；T5：每盆接種根結線蟲3 000 條，各施用20 mL三種液體菌劑，100 mL苦參印楝素稀釋液（1 000 倍），15 d后重復1次。

根結線蟲病級指數［19］：0 級，根系未被侵染，無根結，健康完整；1 級，有極少數根結，根結占根系體積10%以下；3 級，少量根結，根結占根系體積的11%-25%；5 級，根結明顯，根結占根系體積26%-50%；7 級，根系相連，根結占全根系的51%-75%；9 級，多數主根和側根結癭并呈畸形，甚至腐爛，根結占全根系的75%以上。

根結指數［3］=∑（各級病株數×各級嚴重度）/（調查總株數×最高等級數9）×100

相對防效（%）［3］=（對照組根結指數-處理組根結指數）/對照組根結指數×100

2 結果

2.1 SJ5、SJ17、SJ19生防菌的鑒定

2.1.1 菌體形態 SJ5菌株呈粉白色，圓形，表面明 亮，微透明；SJ17菌株呈金黃色，圓形，表面明亮，不透明；SJ19菌株呈乳白色，圓形，表面明亮，不透明（圖1）。

圖1 SJ5、SJ17、SJ19菌體形態Fig.1 Morphology of strain SJ5，SJ17，and SJ19

2.1.2 分子生物學鑒定 根據菌株SJ5、SJ17、SJ19的16S rDNA測序序列通過NCBI進行同源性比對并檢索下載近源物種序列，用標準菌株序列構建系統發育樹。如圖2-圖4所示，菌株SJ5與耐冷假單胞菌 （Pseudomonas psychrotolerans）聚為一支，序列同源性為100%；SJ17菌株與粘金黃桿菌（Chryseobacterium gleum）聚為一支，序列同源性為100%；SJ19菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚為一支，序列同源性為100%；因此SJ5、SJ17、SJ19分別被鑒定為耐冷假單胞菌、黏金黃桿菌、枯草芽孢桿菌。

圖2 菌株SJ5系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of SJ5

圖3 菌株SJ17系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of SJ17

圖4 菌株SJ19系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of SJ19

2.2 線蟲J2的毒力測定

普通光學顯微鏡下觀察統計處理12 h的J2死亡情況（圖5），對照①處理后的南方根結線蟲J2在12 h內無死亡現象。苦參印楝素處理12 h后線蟲的校正死亡率達70.81%，而生防菌SJ5、SJ17、SJ19發酵上清濾液處理后12 h線蟲大量死亡，生防菌SJ5、SJ17、SJ19對J2校正死亡率分別達89.23%、87.95%、88.97%（圖6）。

圖5 顯微鏡下觀察線蟲毒力測定Fig.5 Virulence determination of nematodes under microscope

2.3 生防菌株以及生防菌與植物源制劑之間相 容性

生防菌株SJ5、SJ17、SJ19均能在含有苦參印楝素的LB培養基上生長，且共同培養的菌株之間均未產生抑菌圈（圖7）。

圖7 相容性測定Fig.7 Compatible test results

2.4 不同處理對番茄根結線蟲的防治效果

盆栽45 d后，對照組CK1被根結線蟲侵害嚴重，根短且布滿根結，處理組T5根部發育狀態較好，根結數量少且不明顯（圖8）。不同藥劑處理的番茄根結線蟲根結指數與對照組相比顯著降低（圖9）。氟吡菌酰胺（T1）和噻唑膦（T2）處理組防治效果較高，達到71.24%和69.73%，二者無顯著性差異。生防菌與苦參印楝素復配制劑處理組T5防效為67.75%，與化學藥劑處理組T1、T2無顯著性差異；苦參印楝素處理組T3防效最低，為46.40%。

圖8 不同處理對番茄根系的影響（45 d）Fig.8 Effects of different treatments on tomato root system（45 d）

圖9 不同處理對番茄根結線蟲病的防治效果（45 d）Fig.9 Control effects of different treatments on tomato root-knot nematode disease（45 d）

2.5 不同處理對番茄植株長勢的影響

番茄移栽后45 d，統計株高、莖圍、植株鮮質量和干質量（圖10）。生防菌與苦參印楝素復配制劑處理組T5株高、苗鮮重、苗干重、根鮮重與其他處理組存在顯著差異，且顯著高于空白處理組CK0。莖圍、根干重各組無顯著性差異。

圖10 不同處理對番茄植株長勢的影響（45 d）Fig.10 Agronomic traits of tomato plants under different treatments（45 d）

3 討論

植物線蟲病每年致全球損失至少1 570 億美元，目前市場上的防治線蟲產品仍以化學藥劑為主，噻唑膦和棉隆等常見化學藥劑在市場容量中占比共達73.52%［29］。化學農藥的大量使用導致土壤惡化、作物產量與品質下降、病害加重，對生態環境和食品安全造成了嚴重威脅［30］。通過近幾年“兩減”戰略的有力推行，2020 年底我國順利完成化肥農藥減量提效預期目標［31］，進一步擴大研發安全高效、環境友好的生物制劑勢必更能滿足人民對綠色、高端農產品的需求。

生物防治資源開發近年來取得了較大進展，一些研究表明生防菌復合使用能夠促進植物生長并提高防效［32-37］。Mendoza等［35］人研究發現無毒鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和堅強芽孢桿菌（Bacillus.firmus）聯合使用可有效降低香蕉穿孔線蟲（Radopholus similis）的種群密度。Siddiqui等［36］提出，與單獨使用一種菌劑相比，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）與哈茨木霉（Trichodermaharzianum）協同作用能夠提高生防菌的防效。不同微生物在土壤環境中發揮不同功能，混合微生物功能更加豐富，對病害防控的效果更好［27］。生物防治手段在綠色農業生產中發揮了越來越重要的作用，然而生物防治效果不穩定是目前制約國內外生物防治應用與產業化發展的重要因素［37］，主要原因是微生物對土壤環境的適應性不穩定，植物源農藥相比化學藥劑更易被自然環境分解，隨著作物生長，藥效會逐漸減弱［37］。

目前關于植物源與微生物源制劑聯合防治根結線蟲病鮮有報道，復配制劑防治根結線蟲的機制復雜，其中必須要考慮的因素是制劑之間的相容性［38］。本研究中測試的3株生防菌與苦參印楝素共生長時未發生拮抗作用，證明本研究復配方案中選擇的兩種生物制劑相容性良好。復配防治按照應用方式可以分為：混合發酵、分別發酵后混合施加、分別發酵后間隔一定時間施加等［39-40］。已有研究表明微生物制劑復配時，分別發酵后混合施加的效果優于其他施用方式［41］，故本研究在參考傳統復配方案的基礎上，本研究采用生防菌分別發酵后的發酵濾液與苦參印楝素混合施加灌根的優化復配方案，結果表明施用發酵48 h的3種生防菌濾液（發酵液中有效活菌數≥3.0 億個/mL）與苦參印楝素稀釋液（1 000 倍）復配制劑處理的防效比單獨使用植物源制劑和單獨使用生防菌劑的處理組分別顯著提高了18.61%和7.79%。

自然環境中植物寄生線蟲生防菌資源豐富［42］。本研究中的3株生防菌均分離自番茄根際土壤，更有利于應用時在土壤中定殖。Liu等［43］發現了耐冷假單胞菌具有能夠提高宿主植物養分吸收并幫助宿主固氮的有益特性。Bhise等［44］研究證明粘金黃桿菌能夠在鹽脅迫土壤中生存，并能夠促進植物生長。枯草芽孢桿菌能夠產生嗜鐵素，嗜鐵素不僅是促生長因子，還能防治病害［45］，Ramyabharathi［46］、Mazzuchelli［47］、Abd等［48］通過試驗證明枯草芽孢桿菌能夠用于對非洲菊（Gerbera jamesonii）、甘蔗（Saccharum officinarum）等作物根結線蟲病的防控，且效果較好。本研究首次發現耐冷假單胞菌發酵濾液和粘金黃桿菌發酵濾液具有抑殺根結線蟲J2的作用。盆栽試驗數據表明，3株生防菌發酵濾液與苦參印楝素復配施加后在控制根結線蟲病情的同時還能促進番茄植株生長，具體體現在株高、苗鮮重、苗干重、根鮮重與空白對照組相比均有顯著提高。

目前生物防治根結線蟲病的研究主要集中在單一菌株的防病促生作用，復配研究較少。本研究將微生物制劑與植物源制劑復配進行生物防治，初步發現復配制劑對于番茄根結線蟲病防效更佳、且對番茄植株有顯著促生長作用的結果，為番茄根結線蟲病的防治提供了更豐富的生物資源。在番茄根結線蟲病害防治中，隨著人們對生物防治資源的不斷挖掘和更多新型藥劑的研發，化學農藥減量將成必然趨勢。利用微生物與植物源制劑之間的協同作用提高對番茄根結線蟲病的防治效率，適應于新型藥劑的開發趨勢，一方面使生物防治效果更加穩定，另一方面可顯著減少農藥用量，具有較強的應用潛力和廣闊的發展前景。目前對本研究使用的復配制劑殺蟲的活性成分與大田環境下的作用時效尚不清楚，因此將殺蟲機理與大田應用作為今后的研究重點。

4 結論

本研究從土壤分離出耐冷假單胞菌（P. psychrotolerans）、粘金黃桿菌（C. gleum）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）3株生防細菌，通過室內毒力測試顯示了12 h內對根結線蟲的較高毒力；采用平板抑菌圈法證明生防菌與植物源制劑之間無拮抗作用。盆栽試驗初步驗證，發酵48 h的3種生防菌發酵液（有效活菌數≥3.0 億個/mL）與苦參印楝素稀釋液（1 000 倍）復配制劑處理組對根結線蟲病的防效達67.75%，與化學農藥（氟吡菌酰胺、噻唑膦）處理組相比防效無顯著性差異，且番茄株高、莖圍、苗和根部的生物量均顯著性增加，試驗結論初步發現復配方案具有防治番茄根結線蟲病害應用潛力。