骨科中的細胞力學研究進展*

郎爽，陳恒亭，馬劍雄，馬信龍

(天津醫院中西醫結合骨科研究所，天津 300211)

1 引 言

1.1 細胞力學概念

細胞力學是研究細胞在不同力學環境下的細胞膜和細胞骨架的形變、彈性常數、粘彈性、粘附力等力學參數，來探索細胞、細胞器、蛋白、核酸等構成細胞的生物大分子的力學性質，以及發生在細胞內、細胞膜、核膜內、核酸以及蛋白質中的力學現象。最終用于調節機體細胞生長、發育、成熟、增殖、衰老和凋亡的過程，描述機體的力學機制。

1.2 細胞力學的研究內容

隨著科學技術的進步，研究者將科研重心轉移到細胞水平，以探索細胞微觀結構對細胞整體力學的影響及其作用機制[1]。細胞力學的研究涉及人體的各種細胞，細胞力學的應用推動了細胞和組織工程、心血管力學生物學、骨關節與軟組織生物力學、臨床醫學和康復工程生物力學生物材料等方面的發展，特別是對血液循環系統、人體支撐運動系統、消化系統等相關的細胞進行了廣泛研究[2]，在此主要討論細胞力學在骨科研究中的應用。

1.3 細胞力學的結構基礎

在細胞力學研究中，細胞膜是一層由帶雙鏈的類脂和蛋白質組成的脂雙層膜，細胞膜薄而柔軟，因此可在力的作用下變成任何形狀，相當于二維流質[3]。細胞骨架是細胞的主要機械結構，它是一個極其復雜、動態的蛋白質纖維網絡結構系統，由微管、微絲和中間纖維構成，介導了細胞的運動、附著、分子運輸、細胞分裂以及蛋白質合成等功能[4]。細胞骨架結構的高度非線性特性，使細胞可以感知到細胞的形變和變化，完整的細胞骨架成分有助于細胞和細胞外基質(extracellular-matrix，ECM)之間更緊密地粘附。位于細胞膜上的整合素糖蛋白家族通過ECM與細胞內信號的相互作用來感知機械信號[5]。跨膜受體整合素是連接細胞骨架和ECM以傳遞機械信號的機械感受器，通過膜上鈣通道來調節鈣離子濃度，將胞外的各種信號傳遞至細胞內，引發細胞內信號的級聯反應，進而調節細胞增殖及分化。

2 細胞力學與骨科的聯系

2.1 細胞力學在骨科研究中的應用

目前細胞力學在骨科研究中的應用主要包括細胞整體形狀、功能、變形及與力學性質有關的細胞骨架動力學與細胞-細胞外基質相互作用的機制；在細胞和分子水平上細胞粘附和泳動的生物力學；力學加載導致的細胞損傷；力學因素對骨細胞的生長、重建、信號轉導、基因表達等過程的效應；力學信號誘導干細胞分化及其對生物學模式的影響等方面[2]。細胞力學與骨科學交叉、融合，形成了骨細胞力學，應用細胞力學的概念、方法和手段來研究與骨相關的基礎性科學問題，解決骨關節疾病的臨床實際問題[6]。

2.2 細胞力學在骨科研究中的作用機制

目前，細胞感受力學信號和進行信號轉化的分子機理常見以下幾種。首先附著于ECM是機械傳遞的必要條件。細胞膜感受力學刺激產生變形，并通過ECM粘附蛋白傳遞給細胞骨架。細胞骨架每個組成部分本身就是一個機械感受器，通過細胞骨架各種信號成分、結構蛋白和膜域在空間上被定位，以整合和傳輸機械感覺信號到細胞的機械效應器。整合素作為力的敏感蛋白，因細胞膜上的空間分布以及結構和調控基序的存在，使得其非常適合機械誘導。在力作用下，整合素改變其活性，從而影響細胞-細胞或細胞-ECM之間的黏附行為。

鈣黏著蛋白調節細胞與細胞間的連接。鈣黏著蛋白是一個完整的膜糖蛋白家族，細胞內結構域通過與多蛋白復合物結合，將鈣黏著蛋白粘附在細胞骨架上，再通過細胞骨架調節細胞之間的連接，進而使細胞感知機械環境。

初級纖毛作為細胞力學感受機制之一，當纖毛彎曲時，膜上張力增加導致機械敏感離子通道開放，使細胞內Ca2+流入、膜去極化和神經纖維激活，進而細胞感受力學刺激。從機械刺激的骨細胞中暴露于條件培養基的骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)顯示出對成骨基因的誘導效應，當骨細胞中的初級纖毛形成被抑制時，該效應被消除。

離子通道和連接蛋白常作為力學感受器。在外力作用下，骨組織細胞參與機械敏感性途徑的多種離子通道時蛋白發生構型改變，實現力學信號向化學信號的轉化。連接蛋白是跨膜蛋白六聚體復合物，每個復合物的亞基被稱為連接子，在細胞質膜內形成孔，連接子與相鄰細胞上對應的連接子對齊，產生稱為間隙連接的功能連接。在機械力的刺激下，連接蛋白在體外和體內的表達增加，表明相鄰細胞間產生增強的連接，從而能夠在骨骼網絡內適當地傳遞機械信號。

總之,所有的骨組織細胞有能力直接或間接地應對機械信號,經過力學信號轉換系統，對負荷作出一系列反應，實現通過細胞間通訊和分泌因子去控制成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收活動[4，7]。

3 骨細胞力學的研究進展

3.1 骨細胞力學的主要研究方法

應變力、剪切力、壓力、流體流動、流動電位和加速度等特定因素均可對骨組織細胞產生外力加載作用，通過調節加載力的大小、頻率、應變率等力學參數值，研究力學加載下骨組織細胞產生的影響[4]。在此主要論述現階段細胞力學實驗中常見的幾種力學加載方式。

3.1.1機械拉伸法(Mechanical Stretch) 機械應變力可以通過多種方式施加，主要包括單軸和等軸兩種。Zhao等[8]通過單軸機械拉伸，探索力作用下骨髓間充質干細胞中Wnt/b-Catenin通路的效應；Zhang等[9]通過等軸機械拉伸來探索機械力對人顱骨成骨細胞的細胞外基質相關基因表達的影響。機械刺激、整合素/細胞骨架/Src/ERK信號通路激活和骨細胞存活之間的聯系為機械力在骨骼中的作用提供了機械基礎[10]。

目前機械拉伸在細胞力學中，主要用于研究在機械拉伸作用下骨的一系列細胞形態及相關基因表達的改變，以及不同條件下促進骨重塑的最佳機械拉伸參數。近年，Parandakh等[11]通過細胞的重組和排列以及細胞骨架對平滑肌細胞的調節，發現周期性拉伸可以促進人骨髓間充質干細胞(human mesenchymal stem cells ，hMSCs)的逐步重塑。機械拉伸也有助于大鼠骨髓間充質干細胞(rat mesenchymal stem cells ，RMSCs)定向分化為肌腱/韌帶成纖維細胞[12]。等軸機械拉伸促進人顱骨成骨細胞(Human calvarial osteoblasts，HCObs)的EMC相關基因表達，增強細胞分化過程中的機械信號轉導，從而達到促進骨重塑的作用[9]。Yu等[13]應用機械拉伸法研究力學環境下骨及周圍組織細胞的行為，以及單個細胞的表型反應。研究表明，相關機械傳導途徑的激活將導致相應細胞群的表型反應增強。

研究機械拉伸對某種蛋白信號分子或離子通路產生的抑制或促進作用，可促進骨組織細胞分化、增殖等相關方向的研究。研究發現局灶粘連激酶(FAK)通過整合素信號通路會抑制體外機械拉伸模型誘導大鼠骨髓間充質干細胞的成骨分化[14]。單軸機械拉伸可以通過激活BMSCs 的Wnt/b- Catenin信號通路達到刺激BMSCs的成骨分化和增殖的作用[9]。通過周期性機械拉伸對FZD4受體的直接調控改變了BMSCs成骨分化相關基因的表達[15]。同時，周期性機械拉伸可提高BMSCs的堿性磷酸酶(ALP)活性、低氧誘導因子(HIF)-1α的表達及扭轉，從而誘導骨髓間充質干細胞成骨分化[16]。Chen等[17]通過機械拉伸作用，激活AMPK-SIRT1信號通路，誘導hMSCs產生抗氧化反應和成骨分化，從而促進骨再生。此外，機械力還可調控miRNAs的表達，促進骨重塑，指導骨質疏松、骨折等骨疾病的治療[18]。

將機械拉伸法與某些誘導因子聯合，探索促進骨折愈合的最佳力學參數。研究表明機械拉伸與骨形態發生蛋白9 (BMP9)聯合作用，可促進BMSCs的成骨分化[19]。此外，機械拉伸與20 IU/mL濃度的促紅細胞生成素聯合作用，也可對BMSCs的增殖和成骨分化起到相應促進作用[20]。

3.1.2流體剪切法(fluid shear stress，FSS) 研究表明，骨組織細胞會在FSS作用下發生明顯的生物學效應[21]。在過去的幾十年中，大量研究表明，骨組織細胞在不同流體流動模式和剪切力的作用下會產生不同的增殖效應[22]。

FSS作用下，骨的細胞上的某些自分泌信號對骨重塑和信號轉導具有關鍵作用。McAllister等[23]首次報道了骨髓性細胞對FSS具有敏感性，在流動誘導的剪切應力刺激下，通過釋放NO、PGE2、PGI2等自分泌因子來調節局部吸收活性，從而促進骨重塑和信號轉導。細胞表面化學成分的不同使FSS的作用也不同；與—NH2表面相比，成骨細胞對—OH和—CH3表面具有更高的敏感性和更低的耐受性[24]。FSS通過瞬時受體電位陽離子的TRPV4通道促進成骨細胞增殖并誘導Ca2+內流和BMSCs的成骨分化[25]。通過ERK5負性調節Kruppel樣因子4(KLF4)的表達，可以使KLF4負性調節，從而促進成骨細胞增殖[26]。

大量研究探索了FSS參數對骨重塑的影響。FSS可以破壞細胞與細胞的連接通訊，并重新排列連接蛋白，根據剪切應力的大小決定特異性連接蛋白的重新合成[27]。研究發現，骨的細胞在流體作用下產生的NO與FSS的速率成線性關系，應力的振幅和頻率都有助于骨細胞的流動誘導激活[28]。并且FSS能夠抑制破骨細胞的生成和骨吸收，不同的應力持續時間會引起破骨細胞的不同反應，并且機械應力能夠調節成骨細胞和基質細胞的關鍵因子表達，誘導破骨細胞分化[29]。FSS分別在誘導早期(第4 d)和晚期(第8 d)增強和減弱成骨細胞的鈣振蕩[24]。此外，Mai等[30]通過研究證實了單次短時間FSS也可以促進成骨分化。

探究FSS與某些分子蛋白聯合作用對骨重塑的影響，有研究發現FSS和褪黑素聯合應用可以通過刺激細胞外信號調節激酶p-ERK的表達，從而促進成骨細胞的合成代謝反應[22]。

3.1.3流電位(streaming potentials，SPs)和壓電性(Piezoelectricity) 流電位是由應力產生的流體流動形成的電場。經研究發現SPs可觸發機械傳導過程[31]。可從愈合皮質缺損的編織骨和重塑皮質骨中測量SPs，并且不同愈合階段、不同部位之間的SPs /應變幅度差異似乎與骨阻抗和孔隙率有關，SPs的大小和頻率均能為重構傳遞重要的結構反饋信息，額外的高頻成分可能促進骨重建[32]。

Yasuda是第一個觀察骨組織壓電行為的研究者。隨后，Thi等[31]系統地研究和測量了人和牛股骨干標本的正壓電效應和逆壓電效應。羥基磷灰石的中心對稱晶體結構排除了觀察這些壓電性能的可能性，如去膠原骨。膠原的壓電性可能影響zeta電位的大小，從而影響流動電位。因此，它可以間接地改變骨骼的硬度和流體動力學[33]。

此外，研究發現，光生物調節[34]、適當強度和頻率的低強度脈沖超聲(LIPUS)[35]、壓縮力[36]，及低強度、低頻機械振動(LMLF)[37]等力學加載方式也對骨重塑起促進作用。

3.2 細胞力學對幾種主要骨的細胞的效應

3.2.1破骨細胞(osteoclast，OC) 骨吸收主要由OC介導，OC生成和功能受細胞因子控制，如OC分化因子(RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)[22]，以及受細胞內Ca2+振蕩的調控。FSS通過機械敏感的陽離子選擇性通道導致Ca2+振蕩。OC的STIM1和TRPV4分別充當OC在分化早期和晚期的轉導通道，鈣通道可作為破骨細胞生成或骨吸收的標志[38]。此外，循環拉伸力可以抑制OC的凋亡[39]。通過施加最佳壓縮力可以增加OC數量，釋放該力后，OC的分化和融合受到抑制，可用于指導臨床的正畸治療[40]。

3.2.2成骨細胞(osteoblast，Ob) 成熟的Ob分化受Wnt信號通路控制，通常Wnt信號通路可被激素或機械激活[41]。Ob也可以通過自身的分泌機制直接調節骨基質的合成和礦化。骨吸收是由Ob通過作用于OC的旁分泌因子間接控制的。Ob的分化和成熟過程受力學和生化途徑的雙重調控。研究發現，Runt相關轉錄因子2(Runx2)在Ob前發育中必不可少，它激活Ob特異基因，包括骨橋蛋白、I型膠原、骨鈣素和ALP[42]。RANKL受體激活劑的釋放通過與OC前體表面的RANK受體結合來啟動骨吸收[43]。在Ob即將凋亡時，Ob可以嵌入新形成的骨基質并分化為骨細胞，可以轉化為保護非活性骨表面的非活性骨襯細胞，或啟動凋亡[22]。周期性拉伸通過調節MG63細胞中肌動蛋白結合蛋白(Cofilin)mRNA的表達，cofilin參與了機械負荷誘導的成骨過程的調節，并且 cofilin對Ob機械轉導十分重要[44]。但高水平的機械拉伸可誘導細胞凋亡，而骨膜素對機械拉伸誘導的Ob凋亡具有保護作用[45]。循環拉伸(在0.1 Hz時延伸率為10%)通過調節Akt/mTOR/p70s6k等信號通路，提高了人類Ob樣MG63細胞能量代謝，從能量代謝的角度為Ob力學提供了新穎見解[46]。

3.2.3骨細胞(Osteocyte) 骨細胞可以同時對多種類型的負荷刺激作出反應，特別是對流體流動和靜水壓力更為敏感[47]。骨細胞通過在骨髓空間釋放的分泌因子或直接進入血液循環，向遠處的細胞或器官發出信號，從而感知機械刺激，并將這些信號轉化為影響周圍細胞的生化信號[6]。從Ob到骨細胞的分化過程中，細胞體積減小，細胞開始向礦化基質輻射，礦化基質可由早期骨細胞標志物E11/gp38控制[48]。機械刺激骨細胞通過壓電1-Akt途徑抑制編碼硬結蛋白(Sost)的表達[49]。骨細胞轉化后，ALP、I型膠原和骨形態發生蛋白2(BMP-2)的基因表達降低。其他蛋白質，包括骨鈣素、E11/gp38、硬結蛋白(Sost)被上調或引入[50]。此外，周期性機械拉伸通過抗凋亡作用促進骨細胞樣細胞的網絡發育，通過上調LC3b和atg7的表達改變了骨細胞樣細胞的大小和形狀[51]。同時，骨樣和缺氧條件的礦化也可能是骨細胞形成的驅動力[52]。

3.2.4骨髓間充質干細胞(BMSCs) BMSCs具有多種分化潛能，可作為細胞治療和組織工程的自體細胞源[53]。機械拉伸可誘導細胞骨架重組，通過阻止細胞進入細胞周期的S期而抑制細胞增殖。盡管單純機械牽張不能誘導C3H10T1/2mscs成骨分化，但機械牽張和骨形態發生蛋白9(BMP9)聯合刺激可誘導BMSCs的成骨分化[54]。BMSCs在1 000 Hz應變(μs)s的循環機械負荷時，增強了Ob的活性，促進了BMSCs的Ob分化，并抑制了OC生成[55]。

4 討論

雖然有大量研究探索了骨組織細胞在細胞應力作用下的影響和調節機制方面的相關內容，但這些細胞感知和傳遞機械信號進而轉化為生物信號的轉導系統的精確機制，仍然具有多樣性、復雜性，難以闡述清楚。骨組織細胞在體內的生長環境復雜且獨特，使得無法在體外精準復現體內生長環境模型，降低了體外骨組織細胞的增殖研究的可信性，無法充分說明骨組織細胞在機械應力作用下的體內效應。因此，通過加強科研人員學科綜合交叉創新能力，推動科技發展，將細胞力學研究與臨床需求緊密結合，有望在生物學和醫學層面進一步闡明機械應力對骨組織細胞的作用機制，有助于指導臨床治療，拓展科研與臨床應用相結合的細胞力學新思路。