具有聚集誘導發光效應的熒光探針在生物醫學中的應用*

陳宇航，李瀟

(1.南方醫科大學口腔醫學院，廣州 510515；2.南部戰區總醫院口腔科，廣州 510100)

1 引 言

一直以來，熒光探針都是實驗研究領域的熱點。但傳統的熒光探針在水中容易發生聚集，出現熒光猝滅的現象，即聚集熒光猝滅效應(aggregation caused quenching，ACQ)，因此無法達到長期的成像和信號追蹤效果[1-2]。而在2001年，唐本忠院士研究小組發現了一種噻咯衍生物在薄層層析板上不發光，但隨著溶劑揮發，發光“無中生有”地大幅增強。同樣，當這類分子溶解于良溶劑中處于單分子態時，在紫外光激發下幾乎不發熒光，而在加入水等不良溶劑生成聚集體后，卻發出強烈地熒光。據此，該課題組提出了聚集誘導發光(aggregation induced emission，AIE)這一光物理領域的新概念，克服了聚集熒光猝滅的瓶頸，實現了一場關于熒光探針的歷史變革[3-4]。由于AIE效應的熒光探針克服了傳統熒光分子在濃溶液中會出現聚集導致熒光猝滅的弊端，目前受到廣泛的關注[4]。

2 熒光探針原理及類型

2.1 概述

熒光探針是化學傳感技術領域在20世紀末的一項重大發現，它使得分子識別的方式有了飛躍性的進步。經過大量研究及應用，熒光探針已在發光材料合成、熒光傳感、細胞及組織成像等方面廣泛應用[5]。熒光探針由熒光團(發光基團，Fluorophore) 、識別基團(受體，Receptor) 和連接臂(橋聯基團)3個部分組成，而其機理可大致歸納為四個模型：螯合誘導增強熒光(CHEF)，分子內電荷轉移(ICT)，光誘導電子轉移(PET)和聚集誘導發光(AIE)[6]。其中基于聚集誘導發光機理的熒光探針是我們主要的討論內容。

2.2 AIE熒光探針的原理

具有聚集誘導發光(AIE)性能的熒光探針具有明顯的優勢，是目前研究的前沿。聚集誘導發光與幾種機制通路有關，包括分子內運動的限制(restriction of Intramolecular Motions， RIM)、J聚集形成(J-aggregate formation, JAF)、激發態分子內質子轉移(excited-state intramolecular proton transfer, ESIPT)等。其中RIM是目前研究發現的引起AIE效應的主要原因。因此，本研究以RIM為例，對AIE效應形成的原理機制進行簡要介紹。RIM的機理模型[7]表示，在稀溶液中，AIE分子內部的一些基團有著活躍的相對運動(例如振動和轉動)，處于激發態的分子通過振轉形式將光能以熱能等形式消耗，以光形式輸出能量的比例變小，熒光效率因而降低；而當這些分子聚集在一起時，分子內部運動受到限制，運動熱能的比例降低，光輸出形式的能量比例增加，表現出熒光增強的現象。具體來說，分子內運動包括旋轉和振動，有較大一部分的AIE分子都是以限制分子內旋轉運動為基礎的。比如，常見的熒光分子四苯基乙烯(Tetraphenylethylene, TPE)的結構由四個苯環通過單鍵與中心的乙烯桿相連。苯環可以相對乙烯定子產生很大的自由旋轉或扭轉。在稀溶液中， TPE的孤立分子可以進行主動的分子內旋轉；但在聚合態時由于物理約束，分子內旋轉受到限制，從而打開了輻射衰變通道[8]。除了分子內旋轉運動，也有AIE分子主要進行的是分子內振動。例如10,10'，11,11'-四氫-5,5'-二苯并[a, d]環亞萘基(10,10′,11,11′-tetrahydro-5,5′-bidibenzo[a, d]annulenylidene，THBA)分子內并不存在可旋轉的基團，但它由兩個可伸縮的部分組成，其中每個部分的兩個苯環由可彎曲的彈性部分連接。THBA的分子內振動在某種意義上類似于扇貝的呼吸運動，在聚集態形成時，由于空間限制約束了分子內振動，輻射衰變通道被打開，使THBA在聚合狀態下發射熒光。而JAF機理是指在溶液、添加劑或濃度的影響下，一種染料的吸收帶轉移到一個更長的波長(紅移)，并增加清晰度(更高的吸收系數)[8]。而ESIPT是一種由分子內氫鍵介導的極快的光誘導質子轉移過程。不同的理論各有其證據與適用性，而RIM可以解釋目前為止絕大部分AIE系統的機制[9]。

2.3 AIE熒光探針的類型

AIE熒光探針的分類方式多種多樣，包括根據熒光基團分子構成的分類，根據應用方面的分類，以及AIE基團在聚合物中發揮的功能分類[10]等。熒光基團的分子構成可分為六苯基噻咯(Hexaphenylthiazole，HPS)類，四苯基乙烯(TPE)類，三苯胺(triphenylamine， TPA)類，二苯基乙烯基蒽 (Stilbene anthracene，DSA)類探針等。以四苯基乙烯(TPE)為例[11]，TPE由單鍵連接四個苯環，從而獲得較為自由的運動，其AIE原理可以用上述提到的RIM機理模型來解釋。目前多采用鈀催化交叉偶合反應等方法，將TPE基團與生物染料結合在一起。其AIE的表現高度依賴于連接在染料核上的TPE基團的位置和數量。Baysec等[12]將TPE基團結合于2,6-二溴生物染料的2,6-位置，能有效抑制ACQ，并增強AIE聚集誘導的活性。而三苯胺(TPA)基團富含電子，具有較大的空間位阻、超共軛電子效應以及較高的空穴遷移率，可以和許多生物染料形成強大的電子間相互作用，發出強的熒光。Jiang等[13]通過三苯胺(TPA)與咪唑啉酮結構單元合成了脂滴成像的熒光傳感器，展現出了202 nm的大斯托克斯位移和213 GM的大雙光子吸收截面。

根據應用方面，可將AIE熒光探針分為用于光電設備的制造，熒光傳感(離子探測，pH，機械刺激，溫度刺激，光源刺激等)，生物成像(細胞膜染色，細胞質染色，線粒體染色等)以及醫學應用(監控藥物運輸，結合抗菌能力，腫瘤成像及治療等)。下面主要對AIE熒光探針的離子探測、生物成像及醫學應用三個方面進行討論。

3 AIE熒光探針的應用

3.1 離子探測

不同的離子在實驗研究中扮演著不同角色。如，銅離子(Cu2+)和三價鐵離子(Fe3+)在生理學和病理學反應中承擔著重要的功能，比如氧化還原反應，酶催化反應，氧氣運輸及電子轉運等。另外也有因具有毒性而需要監控其濃度的離子，如汞離子(Hg2+)。以下將對AIE聚合物在離子檢測及生物分子的傳感方面進行討論。

3.1.1Ca2+的檢測 Gao等[14]通過將帶負電荷的亞氨基二乙酸基團作為螯合配體并入水楊苷(SA)中，開發出一種基于AIE效應的熒光探針SA-4CO2Na。在沒有Ca2+離子的情況下，探針SA-4CO2Na可以分散在水溶液中，只發出非常微弱的熒光；而在Ca2+離子存在的情況下，探針可以通過亞氨基二乙酸基團與Ca2+之間的靜電和螯合作用形成高發射性纖化合體。它可以選擇性地探測毫克分子級別(1.0～1.4 mM)的鈣離子，并發出亮光，并區分血中鈣含量過高(1.4～3.0 mM)和正常(1.0～1.4 mM)兩種等級。

3.1.2Hg2+的檢測 有研究發現，汞離子可以與硫脲、硫酰胺、硫酮等物質發生反應，可以在化學上識別出汞促進脫硫機理中的Hg2+。王彬彬等[15]以喹喔啉為基礎開發了一種新型AIE聚合物，二苯基喹喔啉分子。他們通過將1，3—二硫基—2—硫酮部分與2，3—二苯基喹喔啉的核結合，利用二苯基喹喔啉核的AIE特性以及1，3—二硫基—2—硫酮部分與Hg2+的反應活性，建立了一個在水溶液中對Hg2+具有特異刺激熒光感應功能的分子。該化合物表現出對Hg2+的良好特異選擇性，從而區分其他常見的重金屬離子。

3.1.3Cu2+與Fe3+的檢測 Amitha等[16]以熒光素和4—硝基鄰苯二腈為原料，經芳香基硝基取代反應合成了一種新型的4,4—熒光氧基雙苯二腈FPN。FPN的結構由鄰苯二腈-熒光-鄰苯二腈、受體-給體-受體、AD-A型組成，該分子選擇性地表現出對Fe3+離子的熒光關閉行為，其檢測限(Limit of Detection, LOD)為14.49 μM。Jiang等[17]開發了一種能同時檢測Cu2+、Fe3+和半胱氨酸的AIE聚合物。他們通過納米沉淀法形成了一種AIE分子的凝聚體，使其成為一種對Cu2+、Fe3+和半胱氨酸這三種物質具有開關效應的熒光化學傳感器。實驗表明，大部分被測金屬離子僅引起輕微的熒光猝滅，而Cu2+和Fe3+的猝滅熒光強度顯著。

3.1.4Ir3+的檢測 光敏劑(PS)產生純態氧(1O2)的能力是光動力治療(photodynamic therapy , PDT)的關鍵。過渡金屬配合物如銥(Ir3+)配合物由于其理想的光物理性質、較大的斯托克斯位移及高的1O2生成能力，常被用作有效的光敏劑。Zhang等[18]設計并合成了一系列以具有AIE特性的三苯胺(TPA)基團為核心，并含有不同數量Ir3+中心(單核、二核和三核)的紅色聚集誘導發射(AIE) 銥配合物以及相應的納米粒子。與純的銥配合物相比，具有AIE效應的納米粒子具有更長的長激發壽命、更高的1O2生成能力、更好的生物相容性以及更強的細胞攝取能力。

3.2 生物成像

具有AIE效應的熒光探針由于其在成像及監控生物及其生物系統的各種反應方面具有出色的能力，近年來愈發受到關注[19]。我們將從熒光分子與細胞染色的不同部位分類，分別介紹細胞膜染色，細胞質染色，線粒體染色等新型的熒光探針。

3.2.1細胞膜染色 細胞膜(Cytomembrane)是細胞維持穩定代謝的胞內環境的重要屏障，同時它還行使調節和選擇物質進出細胞的功能，并調控細胞的識別和信號傳導。Wang等[20]報道了一種新型的水溶性AIE材料，名為TTVP，是一種由三苯胺基團、噻吩片段及碳碳雙鍵組成的DA型化合物。它無需經過洗滌過程便超快速地對分析物進行著色，并特異性地作用于細胞膜，發出紅外光譜區域的熒光。

3.2.2細胞核染色 細胞核(Nucleus)里儲存著大量的細胞遺傳物質，對其進行染色成像在生物醫學的研究及臨床醫學的應用都具有重要的意義。Yu等[21]開發出一種具有AIE效應的細胞核染色劑，它是一種α—氰基二苯乙烯衍生物(ASCP) ，并通過研究發現該分子是一種良好的細胞核染色劑。不會破壞細胞的完整性，可實現對細胞的成像，并進行長期的示蹤。Lv等[22]設計并合成了一種對細胞核具有特異性的AIE熒光探針，與市售藥物DAPI(4',6—二脒基—2—苯基吲哚)相比，該熒光探針有較大的斯托克斯位移(175 nm)和光穩定性，與細胞核更親近。進一步的實驗表明，該探針可以通過染色癌細胞核高度區分正常細胞與癌細胞，并且能進一步用于長時間的癌癥細胞核的成像及追蹤。

3.2.3線粒體染色 線粒體是一種半自主細胞器，能產生細胞的能量貨幣——腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)。能夠選擇性地標記細胞內線粒體并產生熒光的探針是監控細胞凋亡和退化的強有力的方法[21]。Leung等[23]研究了一種用線粒體靶向識別基團修飾的具有AIE效應的熒光探針。他們以四苯基乙烯(TPE)為基礎，將其與三苯基磷(TPP)組合。具體合成過程是先由McMurry偶聯反應合成具有AIE效應的TPE核，然后與三苯基膦的后續反應連接形成TPE-TPP。該合成物TPE-TPP能特異性地對活細胞內的線粒體標記熒光，具有出色的光穩定性。

3.2.4脂滴染色 脂滴即脂質液滴，與各種生理過程有著密切的聯系，其數量及活動都與許多疾病(如癌癥)相關聯。Wang等[24]通過簡單的合成和提純操作做出了兩種簡單的熒光分子(FAS和DPAS)，這兩種分子都展現了聚集誘導發光(AIE)和激發態分子內質子轉移(ESIPT)特性。具有良好生物相容性地FAS和DPAS都能特異性地在活細胞的脂滴中累積，并在聚集態分別發出亮橙色和黃色的光。

3.2.5植物細胞染色 AIE發光物在農業，植物工程學中也有應用。Wang等[25]以一種化學物異長葉烷酮為基礎，設計了五種六羥喹唑啉—2—胺基衍生物，成功合成后展示出了良好的AIE特性。這些衍生物可以在固態時呈現出增強的熒光強度，并且能夠特異性地對鋅離子進行熒光成像。他們進一步地用蜀葵植物細胞作為參照，成功地對蜀葵花粉粒內的鋅離子成像。

3.3 醫學應用

與許多傳統的有機染料或探針相比，AIE效應的熒光探針對光漂白的抗性強，由于其以聚合物形式釋放，因此效率更高，且一般具有良好的生物相容性，細胞毒性較小。如今，關于具有AIE效應的熒光探針在醫學方面的應用研究已非常廣泛，各種能對離子、細胞結構進行熒光成像的分子被報道出來。除此之外，也有許多研究將重點放在了熒光探針的其他醫學功能方面，如監控藥物的運輸與釋放、結合抗菌藥物、腫瘤成像及治療等，有的AIE熒光物還同時兼具上述的幾種醫學功能。比如，一種利福平負載的AIE載體[26]被證實可定位肉芽腫，并在感染的早期階段發出熒光信號，達到早期診斷結核病的目的。而在抗菌方面，許多學者將AIE熒光基團與其他抗菌物相結合，合成了新型的AIE抗菌材料[27]，通過不同的機制殺滅細菌[28-30]。同時，AIE熒光探針在抗腫瘤治療方面也有廣泛的應用[31-34]。另外，還有涉及其他領域的應用，如在口腔牙周醫學領域中，構建AIE熒光探針用于檢測牙菌斑生物膜[35]。

3.3.1監控藥物的運輸及釋放 Li等[36]開發了一種用于藥物運輸的新型的磷酸分子，1,2—二(4—硼酸基苯)—1,2—二苯乙烯(PATPE)，它在DMSO-H2O溶液中，以預備過的四苯基乙烯和其酯衍生物為基，展現出AIE的效應。接著他們將該PATPE分子以一步凝結法與羥基磷灰石組裝起來，形成一個橢圓型中空的納米膠囊。該納米膠囊在紫外線下發出強的藍光，可以進一步用于監控藥物的運輸。他們主要是以布洛芬為模型藥物進行了模擬，并得出了該納米膠囊通過熒光強度的改變，能有效顯示藥物釋放的整個過程。

3.3.2抗菌性能與AIE熒光效應的結合 Zheng等[37]開發了一種既具有抗菌性能，又有AIE效應的混合物，是以共價結合的形式將抗菌金納米簇(Au NCs)和達托霉素(Dap)結合在一起的發光物。他們通過Dap的羧基與濕分子的氨基之間的強共價鍵(酰胺)，將Dap與Au—NCs共價結合，制備了Dap—AuDAMP NCs化合物。進一步的研究顯示，由于AIE效應，這種以4,6—二氨基—2—巰基嘧啶介導的熒光離子可以提供最大約4倍的增強熒光。

3.3.3AIE熒光探針在腫瘤成像及治療的應用 與惡性腫瘤的抗爭一直以來都是醫學界的重要課題。Shao等[38]開發一種能對腫瘤細胞進行成像的有機喹啉-丙二嗪(QM)納米探針，這是一種可由遠紅外和近紅外光激發產生AIE效應的具有良好生物相容性并能應用于細胞示蹤的熒光探針。他們設計出了以QM為基礎的幾種衍生物，并以QM-2和QM-5為例，經過實驗得出其對于正常細胞及腫瘤細胞都表現出低毒性的結果，并且經過24 h與HeLa細胞的孵育后表現出亮的熒光。而Wang等[39]通過將AIE熒光基團1,2—二(4—羥苯基)1,2—二苯乙烯與非變位的聚乙炔聚醚腈(polyarylene ether nitrile, PEN)的結合獲得具有AIE效應的PEN。將此AIE-PEN交聯到具有良好生物相容性的水溶性熒光納米球中，可以成功對癌細胞進行生物成像。Zhang等[40]開發了一種用于腫瘤光動力學治療的AIE光敏劑，它是一種聚合物膠束，由包含水楊醛的兩親性聚合物的自組裝形成，將其命名為AIE-M。它可以在溶液中釋放光輻射并產生活性氧，經由腫瘤細胞攝取后，特異性地先逗留在細胞膜上，接著顯著地在細胞線粒體中停留，從而釋放出熒光效應的同時產生活性氧，使腫瘤細胞凋亡及壞死。它在無光照時可忽略的毒性以及有光照時的光毒性使其在影像指導的腫瘤光動力學治療(PDT)中具有讓人期待的潛力。

3.3.4探測牙菌斑生物膜 于娜等[35]基于TPE特殊的發光機制構建了一種具備熒光信號“開關”功能的牙菌斑生物膜檢測探針TR4。該探針的熒光部分由四苯基乙烯(tetraphenylethylene, TPE)組成，并與棕櫚酸和親水多肽R4共價連接形成，分別起熒光生發、粒子組裝與靜電吸附的作用，通過調節TPE的聚集狀態實現熒光的開關。TR4中的多肽R4具有較強的正電荷，可以引導TR4通過靜電相互作用與表面帶有負電荷的牙菌斑生物膜結合。結合過程會屏蔽TR4分子的正電荷，使TR4發生自組裝形成納米粒子，誘導TPE分子的聚集發光?？蓪崿F對牙菌斑生物膜的檢測，是一種既快速又便捷的檢測手段。

4 總結與展望

由于AIE分子與傳統的其他熒光染料相比，能克服ACQ效應，研究者能積極利用聚合過程而不必考慮如何阻止熒光物形成聚集態，使熒光的應用范圍得以擴展。AIE熒光探針在生物醫學方面應用廣泛，包括發揮熒光傳感功能、細胞成像、藥物運輸及治療等方面。目前有許多AIE分子會隨外界刺激或環境的變化(如pH、溫度、溶液中離子濃度等)而發生熒光的變化，與分析物存在“超增強”效應，因此，可以作為探測離子濃度變化的敏感探針應用；由于AIE分子大多具有良好的生物相容性，通過對熒光基團的修飾，可以作為敏感且成像清晰的細胞染料，目前也有許多研究設計了各種用于細胞核、細胞膜等染色的AIE熒光物；此外，還有研究者對于AIE探針在其他醫學方面的研究擴展，利用不同的策略(如：與抗菌藥物的化學鍵進行共價結合、利用羥基磷灰石等大分子組裝等)組建了不同的AIE分子，實現了其在腫瘤細胞的示蹤、腫瘤光動力治療、藥物運輸與釋放的熒光顯像等方面的應用。

盡管目前AIE分子已有了較成熟的研究與應用，但仍然存在一些未解決的問題。一方面，開發及應用能吸收及發射長波長的AIE分子仍具挑戰；另一方面，目前常見的AIE探針分子在水溶性方面仍有缺陷。隨著Wang等[20]開發的一種具有水溶性的AIE分子TTVP的出現，如何獲得具有良好水溶性的AIE分子的方法或許會成為熒光成像技術的研究方向之一。自2001年唐本忠院士研究小組發現了AIE現象以來，AIE熒光探針已在實驗研究的許多方面得到應用，而其更深層的機制和更獨特的優勢仍值得我們進一步去發掘。