低劑量電離輻射對STZ 誘導糖尿病模型大鼠海馬神經元的影響

劉 飛, 梁 碩, 王櫟萱, 秦麗晶, 郭 偉, 王志成

（1. 吉林大學公共衛生學院 國家衛健委放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021；2. 武警吉林總隊醫院第二門診部，吉林 長春 130052）

目前有關電離輻射對人體的作用已積累了大量資料，關于低劑量電離輻射（low dose radiation，LDR）的生物學作用，特別是對神經系統的作用，已成為人們關注的焦點［1-4］。早期的研究［5］表明：LDR 對大腦具有保護作用，其原因可能是LDR 增加抗氧化特性和降低脂質過氧化。體內實驗研究［6-8］表明：LDR 不能誘導有害的認知改變，對神經細胞功能、DNA 和相關基因表達無明顯影響，并且可以刺激細胞和分子的保護效應。研究［9-10］表明：糖尿?。╠iabetes mellitus，DM） 高血糖狀態時可促進活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，ROS 生成增加導致胰島β 細胞生長阻滯和細胞凋亡的發生，是DM 發生機制之一。在對大腦神經損傷的防護中，抗氧化是一個重要的途徑，LDR 通過誘導抗氧化活性對大腦發揮保護作用，且對大腦不具有損傷效應［11-12］。因此，本研究通過鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導Wistar 大鼠建立DM 模型，給予LDR 處理，探討大鼠海馬神經元細胞周期進程、鈣離子濃度（［Ca2+］i）和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）的變化，為DM 腦損傷的治療提供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器60 只雄性Wistar大鼠購自吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（吉）203-2007。實驗前大鼠室內適應環境1 周，自由進水和進食。STZ、Fluo-3 和Pluronic F-127（美國Sigma 公司），羅丹明123（大連美侖生物技術有限公司），其他試劑為國產分析純。血糖儀及配套試紙（美國強生公司），X-RAD 320iX 生物輻照儀（美國Precision X-ray 公司）。

1.2 大鼠DM 模型制備大鼠造模前禁食12 h，不禁水，造模時行50 mg·kg－1STZ（10 g·L－1）左下腹腔一次性注射，注射2 d 后利用尿糖試紙檢測空腹12 h 尿糖，取尿糖≥大鼠再次注射STZ，3 d 后尾靜脈取血利用血糖試紙檢測，如血糖值大于16.7 mmol·L－1，且出現“三多一少”癥狀，則可以認定大鼠DM 模型制備成功。

1.3 實驗動物分組及LDR造模成功大鼠分為DM 組、DM + 25 mGy X 射線照射組、DM+50 mGy X 射線照射組和DM + 75 mGy X 射線照射組，同時選取正常大鼠作為正常對照組，每組12 只。LDR 采用X-RAD 320iX 生物輻照儀照射，劑量率為12.5 mGy·min－1，電壓180 kV，電流15 mA，隔日照射，照射12 次。

1.4 流式細胞術檢測大鼠不同細胞周期海馬神經元百分率LDR 照射結束后繼續飼養4 周，麻醉后處死大鼠，迅速取出大腦后置于冰上，剪開大腦后輕柔地剝離海馬，并置于冷生理鹽水中漂洗血液，每組取4 只，放于5 mL PBS 緩沖液中，利用毛玻璃輕輕研磨成單細胞懸液，并經200 目尼龍網過 濾，1 500 r·min－1離 心5 min 后 計 數，定 容后 待 測。 取 1×106個 細 胞，加 入 RNA 酶（0.03 g·L－1）80 μL，PI （0.05 g·L－1，含0.03%Triton X-100）150 μL，4 ℃條件下避光30 min 后采用流式細胞儀檢測不同細胞周期細胞百分率，采用CellQuest 軟件收集細胞，至少收集1 × 104個細胞，ModFit 軟件分析結果，結果以百分率表示。

1.5 大鼠海馬神經元中［Ca2+］i 檢測每組取上述1 × 106個大鼠海馬神經元，PBS 緩沖液洗2 次后加入Fluo-3（終濃度為5 μmol·L－1） 和Pluronic F-127（終濃度為0.062 5%），室溫條件下孵育30 ～50 min，PBS 緩沖液再洗2 次后，采用CellQuest 軟件收集細胞，至少收集1 × 104個細胞，ModFit 軟件進行［Ca2+］i 檢測，以平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI） 值表示大鼠海馬神經元中［Ca2+］i。

1.6 大鼠海馬神經元MMP 檢測每組取上述海馬神經元1 × 106個，PBS 緩沖液洗2 次后加入0.2 μL 羅丹明123，37 ℃條件下反應15 min，PBS緩 沖 液 洗2 次，1 500 r·min－1離 心5 min，上 機 檢測，CellQuest 軟件收集至少1 × 104個細胞，ModFit 軟件進行結果分析，以MFI 值表示大鼠海馬神經元MMP。

1.7 統計學分析采用SPSS 24.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠體質量、海馬神經元中不同細胞周期細胞百分率、［Ca2+］i 和MMP 均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠體質量造模成功后未進行LDR前，各組大鼠體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05），可以用于后續研究。正常對照組大鼠體質量隨著時間的延長逐漸增加；與正常對照組比較，DM 組、DM+25 mGy X射線照射組、DM+50 mGy X 射線照射組和DM + 75 mGy X 射線照射組大鼠體質量在各時間點均明顯降低（P＜0.05）；與DM 組比較，X 射線照射后4 周后DM + 50 mGy X 射線照射組和DM +75 mGy X 射線照射組大鼠體質量明顯增加（P＜0.05）。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠體質量Tab.1 Body weights of rats in various groups at different time points

表1 不同時間點各組大鼠體質量Tab.1 Body weights of rats in various groups at different time points

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs DM group.

Group Body weight 4 weeks after LDR 524.0±15.1 215.2±1.7*223.2±4.4*234.0±28.4*△238.8±5.8*△Normal control DM DM + 25 mGy X-ray irradiation DM + 50 mGy X-ray irradiation DM + 75 mGy X-ray irradiation Before LDR 211.0±10.7 207.2±18.3 204.0±11.4 204.6±10.4 199.2±7.3 2 weeks of LDR 260.8±10.5 209.2±2.7*206.9±1.6*212.5±1.9*209.5±2.7*4 weeks of LDR 324.0±19.1 212.2±7.7*216.2±4.4*224.0±5.4*223.8±5.8*

2.2 各組大鼠不同細胞周期海馬神經元百分率與正常對照組比較，DM 組、DM+25 mGy X 射線照射組、DM+50 mGy X 射線照射組和DM +75 mGy X 射線照射組大鼠S 期海馬神經元百分 率 明 顯 增 加（P＜0.05）； 與DM 組比較，DM + 25 mGy X 射 線 照 射 組、DM + 50 mGy X 射線照射組和DM+75 mGy X 射線照射組大鼠S 期海馬神經元百分率明顯降低（P＜0.05）。見 圖1 和表2。

圖1 流式細胞術檢測各組大鼠不同細胞周期海馬神經元百分率Fig.1 Percentages of hippocampal neurons in different cell cycles of rats in various groups detected by flow cytometry

表2 各組大鼠不同細胞周期海馬神經元百分率Tab. 2 Percentages of hippocampal neurons at different cell cycles of rats in various groups

表2 各組大鼠不同細胞周期海馬神經元百分率Tab. 2 Percentages of hippocampal neurons at different cell cycles of rats in various groups

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs DM group.

Group S Normal control DM DM + 25 mGy X-ray irradiation DM + 50 mGy X-ray irradiation DM + 75 mGy X-ray irradiation Percentage of hippocampal neurons G0/G1 87.6±3.8 85.4±0.9 3.9±0.4 6.3±0.3*G2/M 8.6±0.6 8.4±1.0 87.7±2.6 4.7±0.8*△7.6±1.4 87.2±0.8 3.5±0.4*△9.7±0.9 86.4±2.5 4.5±0.6*△9.1±0.9

2.3 各組大鼠海馬神經元中［Ca2+］i 和MMP與正常對照組比較，DM 組、DM+25 mGy X 射線照射組和DM + 50 mGy X 射線照射組大鼠海馬神經元中［Ca2+］i明顯增加（P＜0.05），DM + 75 mGy X 射線照射組大鼠海馬神經元中［Ca2+］i 明顯降低（P＜0.05）；與DM 組比較，DM + 50 mGy X 射線照射組和DM + 75 mGy X 射線照射組大鼠海馬神經元中［Ca2+］i 明顯降低（P＜0.05）；與DM+25 mGy X 射線照射組比較，DM+75 mGy X 射線照射組大鼠海馬神經元中［Ca2+］i 明顯降低（P＜0.05）。與正常對照組比較，DM 組和DM + 25 mGy X 射線照射組大鼠海馬神經元MMP 明顯降 低（P＜0.05）；與DM 組 比 較，DM+50 mGy X 射線照射組和DM + 75 mGy X 射線照射組大鼠海馬神經元MMP 明顯升高（P＜0.05）；與DM+25 mGy X 射線照射組比較，DM+50 mGy X 射 線 照 射 組 和DM + 75 mGy X 射線照射組大鼠海馬神經元MMP 明顯升高（P＜0.05）。見圖2 和表3。

圖2 流式細胞術檢測各組大鼠海馬神經元MMPFig.2 MMP of hippocampal neurons of rats in various groups detected by flow cytometry

表3 各組大鼠海馬神經元中[Ca2+]i 和MMPTab. 3 [Ca2+] i and MMP of hippocampus neurons of rats in various groups

表3 各組大鼠海馬神經元中[Ca2+]i 和MMPTab. 3 [Ca2+] i and MMP of hippocampus neurons of rats in various groups

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs DM group；#P＜0.05 vs DM + 25 mGy X-ray irradiation group.

Group Normal control DM DM+ 25 mGy X-ray irradiation DM+ 50 mGy X-ray irradiation DM+ 75 mGy X-ray irradiation[Ca2+]i 9.4±0.9 14.7±1.5*14.8±0.5*12.2±0.6*△6.5±0.4*△#MMP 31.3±4.3 25.1±1.4*25.8±1.0*30.5±1.6△#29.1±0.1△#

3 討 論

STZ 誘導DM 時，高血糖影響大腦各個區域神經元的降解，包括扣帶回皮質、丘腦核和海馬體，主要與ROS 的產生有關［13-14］。

海馬體對記憶具有重要作用，能夠將其存入大腦皮層轉變成永久記憶。海馬神經元一旦受損，則出現明顯的記憶力下降現象，并導致焦慮癥的發生［15］。因此，如何提高DM 神經損傷的保護作用具有重要的意義。以往研究［6-8］顯示：LDR 對細胞具有抗氧化和抑制凋亡的作用。

研究［16-18］表明：DM 時海馬神經元由高 血 糖誘導的凋亡是海馬損傷的一個重要途徑。而且在凋亡過程中，凋亡的線粒體調控途徑涉及到持續的高血糖狀態，可以使MMP 及細胞膜滲透性發生變化，膜通透性轉運孔開放，膜去極化，使得線粒體內促凋亡因子釋放到細胞漿中，激活caspase-3，引發級聯反應，從而誘發細胞凋亡。在此過程中，MMP 的改變是早期事件。在本研究中，DM 模型大鼠海馬神經元MMP 較正常對照組明顯降低，而25 mGy LDR 未能逆轉MMP 的降低，但50 和75 mGy 的LDR 則使MMP 基本恢復到正常水平，提示其具有抗凋亡的作用。另外，［Ca2+］i 的改變也是細胞凋亡的一個指標，當細胞膜去極化后，可以誘導細胞內鈣離子堆積，濃度升高，進而啟動細胞凋亡［19-20］。

研究［21-22］表明：氧化應激與鈣離子平衡之間也存在交互作用，如順鉑誘導ROS 生成時，也能夠破壞鈣離子平衡。本研究結果顯示：DM 模型組大鼠海馬神經元中［Ca2+］i 明顯升高，而DM +50 mGyX 射線照射組和DM + 75 mGy X 射線照射組大鼠海馬神經元中［Ca2+］i 明顯降低。細胞周期進程按照一定的順序有序進行，在外來刺激下，細胞周期檢查點激活，從而使細胞發生阻滯，以完成對外來刺激的適應。當細胞發生周期阻滯時，影響細胞DNA 合成和分裂等事件，甚至可以誘導凋亡。本研究結果顯示：DM 組大鼠海馬神經元中S 期細胞百分率明顯升高，提示DM 發生后海馬神經元產生明顯的S 相延遲，而LDR 則能有效地降低該作用，從而使細胞恢復到正常的有絲分裂狀態。

綜上所述，本研究利用STZ 誘導建立大鼠DM模型，LDR 能有效地減輕DM 大鼠海馬神經元損傷，其機制主要是通過改善DM 大鼠海馬神經元S 期延遲、恢復海馬神經元中［Ca2+］i 和逆轉MMP 降低，進而發揮神經保護作用。本研究結果為LDR 治療DM 腦損傷提供了必要的實驗證據。