aaptamine 與順鉑聯合用藥對人肺腺癌順鉑耐藥A549/DDP 細胞的協同抑制作用

苗 雙, 倪 娜, 楊麗娟, 武 艷, 李雪琳, 董洪亮, 宮凱凱

（1. 濱州醫學院附屬醫院腫瘤研究實驗室，山東 濱州 256603；2. 濱州醫學院附屬醫院臨床實驗中心，山東 濱州 256603）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，約占腫瘤致死率的27%，隨著大氣污染和吸煙人群的增加，肺癌成為威脅人類健康的頭號殺手［1-3］。以鉑類為基礎的化療，尤其是順鉑（DDP），是治療肺癌最為有效的化療藥物［4］，然而肺癌細胞耐藥性的產生嚴重限制了DDP 的臨床應用［5］，因此逆轉DDP 耐藥性或增強其化療敏感性是目前臨床上亟待解決的問題［6-7］。aaptamine 分離自尋常海綿綱海綿，是一種具有特殊苯并二氮雜萘母核的典型海洋來源生物堿［8］。研究［9-11］表明：aaptamine 具有良好的抗腫瘤活性，在慢性髓細胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）細胞和骨肉瘤細胞中，aaptamine能夠不依賴于P53 誘導P21 的表達，在較低濃度時將細胞周期阻滯于G2/M 期，而在較高濃度時則不同程度地誘導細胞凋亡。在DDP 耐藥的人胚胎細胞癌NT2-R 細胞中，aaptamine 能夠抑制腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡，通過對蛋白表達譜分析推測c-myc 和P53 可 能 為aaptamine 的 作 用 靶 點［12］。BOWLING 等［13］發 現：aaptamine 可 以 與DNA 發生交聯作用因而具有細胞毒抗病毒活性。此外，FUNK 等［14］發 現：aaptamine 能 夠 通 過 干 擾DDP引起的DNA 損傷反應（DNA damage response，DDR），減輕DDP 對大鼠腎細胞的作用。鑒于aaptamine 良好的抗腫瘤活性和對化療損傷的保護作用，有必要對其作用機制進行深入的研究。目前國內外關于aaptamine 聯合DDP 協同抑制肺癌的研究尚未見報道。本實驗室前期通過天然產物分離技術，獲得aaptamine 單體，且證實aaptamine 可以明顯抑制肺癌A549 細胞和H1299 細胞的增殖。本研究通過多種實驗方法探討aaptamine 和DDP 聯合用藥對人肺腺癌DDP 耐藥細胞A549/DDP 的協同抑制作用及其抗耐藥分子機制，以期為克服腫瘤化療耐藥瓶頸提供新線索。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人肺腺癌DDP 耐藥細 胞 A549/DDP 購 自 美 國 ATCC 細 胞 庫。aaptamine 為本實驗室從海綿Aaptos suberitoides中分離得到，化學結構見圖1。胎牛血清、RPMI-1640 培養基和胰酶購自美國Gibco 公司，DDP 購自美國MCE 公司，B 細胞淋巴瘤2 原癌基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相 關X 蛋 白（Bcl-2-associated X，Bax）、 三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2 （ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2） 和切除修復交叉互補基因1（excision repair cross complementing group 1，ERCC1） 單克隆抗體購于美國Abcam 公司，Tublin 抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 抗體購于美國Proteintech 公司，CCK-8 試劑盒購于日本同仁化學研究所，膜聯蛋白V-FITC/PI 檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。CO2細胞培養箱購于美國Thermo 公司，倒置顯微鏡購于德國Leica 公司，酶標儀購于美國BioTek 公司。

圖1 aaptamine 的化學結構Fig.1 Chemical structure of aaptamine

1.2 細胞培養A549/DDP 細胞用含有10%胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素的RPMI-1640 培養基，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養箱中培養和傳代。

1.3 半數抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）的測定和藥物組合方案的篩選取對數生長期A549/DDP 細胞制備單細胞懸液，采用臺盼藍計數，將細胞以1×104個/孔接種于96 孔細胞培養板，每孔接種100 μL 細胞懸液，培養24 h 后采用藥 物 處 理，DDP 濃 度 梯 度 為0、 1.25、 2.50、5.00、10.00 和20.00 mg·L－1，aaptamine 濃度梯度為0、1、2、4、8、16、32 和64 mg·L－1，每 孔行3 個重復，培養48 h 后，每孔加入10 μ L CCK-8溶液，繼續培養2 h，應用酶標儀測定各孔在450 nm 波長處的吸光度（A）值，以僅加入培養基的對照孔為空白調零，實驗重復3 次。用Graphpad Prism 7.0 軟件計算IC50值，以藥物濃度的對數值為橫坐標，細胞存活率為縱坐標，細胞存活率為50%時對應的藥物濃度為IC50值。以aaptamine 的IC50值 為 參 考，設 置 濃 度 為5、 10、 15 和20 mg·L－1，為減少DDP 的不良反應，將DDP 濃度設置為1 和2 mg·L－1，分別單獨加藥或兩兩組合，采用CCK-8 法考察單獨及聯合用藥后細胞的抑制率，利用CompuSyn 軟件中的Chou-Talalay 中效分析法［15］對CCK-8 法檢測結果進行分析，計算聯合指數（CI）值，若CI＜1，認為兩藥為協同作用，CI＝1 為相加作用，CI＞1 為拮抗作用。

1.4 CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性取對數生長期A549/DDP 細胞制備單細胞懸液，采用臺盼藍計數，將細胞以1×104個/孔接種于96 孔板，每孔接種100 μL細胞懸液。細胞培養24 h后分為4組：對照組不加藥，aaptamine 組加入5 mg·L－1aaptamine，DDP 組 加 入1 mg·L－1DDP，聯 合 用 藥 組 加入5 mg·L－1aaptamine 和1 mg·L－1DDP，每 孔行3 個重復，分別在24、36、48、60 和72 h 加入10 μL CCK-8 溶液，繼續培養2 h，應用酶標儀測定各孔在450 nm 波長處的A 值，以僅加入培養基的對照孔為空白調零，實驗重復3 次，以平均A 值代表細胞增殖活性，對照組進行均一化處理后，采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪制細胞生存曲線。

1.5 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆數細胞分組方法同“1.4”。按每孔500 個A549/DDP 細胞的密度接種于12 孔板，每孔接種1 mL 細胞懸液。37 ℃孵育24 h 后加藥處理，后每隔3 d 更換1 次含有藥物的培養液，處理14 d 后，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 緩沖液洗脫3 次，結晶紫染色20 min，PBS 緩 沖 液 洗 脫3 次，拍 照，采 用Image J 軟件統計數據，計算細胞克隆數，以細胞克隆數＞50 計為1 個克隆。實驗重復3 次。

1.6 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移率細胞分組方法同“1.4”。將A549/DDP細胞按1×105個/孔的密度接種于6 孔板，每孔接種1 mL 細胞懸液，細胞培養至80%左右時用200 μL 無菌槍頭劃痕并加藥處理，加藥0、24 和48 h 后于倒置顯微鏡下觀察、拍照，采用Image J 軟件對劃痕距離進行分析，并用Graphpad Prism 7.0 軟件計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h 劃痕間距－24 或48 h 劃痕間距）/0 h 劃痕間距×100%。實驗重復3 次。

1.7 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率細胞分組方法同“1.4”。 將A549/DDP 細胞按1×105個/孔的密度接種于6 孔板，每孔接種1 mL 細胞懸液，培養24 h 后加藥處理。藥物處理48 h 后收集細胞，采用膜聯蛋白V-FITC/PI 檢測試劑盒測定細胞凋亡率，用預冷的PBS 緩沖液洗滌2 次并輕輕重懸于100 μL 結合緩沖液中，采用5 μL 膜聯蛋白V-FITC和5 μL PI 溶液染色，并采用流式細胞儀檢測。采用FlowJo 7.6 軟件進行進行數據分析，細胞凋亡率＝（早期凋亡細胞數＋晚期凋亡細胞數）/細胞總數×100%。實驗重復3 次。

1.8 Western blotting 法檢測各組細胞中ABCG2、ERCC1、Bax 和Bcl-2 蛋白表達水平細胞分組方法同“1.4”。 將A549/DDP 細胞按1×105個/孔的密度接種于6 孔板，每孔接種1 mL 細胞懸液，培養24 h 后用藥處理。藥物處理72 h 后收集細胞提取細胞總蛋白，BCA 法定量蛋白濃度，取30 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 后，PVDF 轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗（1∶1 000） 孵育過夜，TBST 清洗，二抗（1∶2 000） 孵育2 h，TBST 清洗，ECL 顯色曝光。實驗重復3 次，采用Image J 分析軟件，以Tubulin 蛋白為內參，計算目的蛋白表達水平及Bax/Bcl-2 蛋白表達水平比值。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.9 統計學分析采用Graphpad Prism 7.0 軟件進行統計學分析。各組細胞增殖活性、克隆數、細胞劃痕愈合率、細胞凋亡率及各蛋白表達水平和Bax/bcl-2 比值，均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1aaptamine 和DDP 的IC50 值 及 聯 合 用 藥 藥 物濃度的確定首先測定aaptamine 和DDP 單獨用藥對A549/DDP 細 胞 的IC50值，aaptamine 和DDP 的IC50值分別為19.45 和12.86 mg·L－1。采用CCK-8法檢測不同濃度aaptamine 與不同濃度DDP 單獨或聯合用藥后A549/DDP 細胞抑制率，并用CompuSyn 軟件計算兩者的CI，結果顯示：5、10、15 和20 mg·L－1aaptamine 與1 或2 mg·L－1DDP的CI 均小于1，說明二者均有協同作用，當aaptamine 濃度為5 mg·L－1、DDP濃度為1 mg·L－1時，A549/DDP 細胞的抑制率為41%。因此為減少藥物的不良反應，選擇最小的藥物濃度，即aaptamine 5 mg·L－1和DDP 1 mg·L－1作 為 后 續 實驗濃度。

2.2 各組A549/DDP 細胞增殖活性加藥處理后48、60 和72 h，與 對 照 組、aaptamine 組 和DDP 組比較，聯合用藥組細胞增殖活性明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性Fig. 2 Proliferation activities of cells in various groups detected by CCK-8 assay

2.3 各組A549/DDP 細胞克隆數加藥處理后各組細胞培養14 d，聯合用藥組細胞克隆數（42.0±8.0）明顯低于對照組（180.5±25.0）、aaptamine組（144.5±15.0） 和 DDP 組 （115.5±12.0）（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖3。

圖3 結晶紫染色觀察各組細胞克隆形成能力Fig.3 Colonal formation abilities of cells in various groups detected with crystal violet

2.4 各組A549/DDP 細胞遷移率加藥處理24 h后，對照組、aaptamine 組、DDP 組和聯合用藥組細胞遷移率分別為（55.00±5.31）%、（45.80±4.83）% 、 （29.40±3.57）% 和 （17.30±2.31）%；加藥處理48 h后，對照組、aaptamine組、DDP 組和聯合用藥組細胞遷移率分別為（70.40±8.31）%、（67.70±5.25）%、（54.50±4.89）%和（27.8±2.19） %。加藥處理24 和48 后，與對照組、aaptamine 組和DDP 組比較，聯合用藥組細胞遷移率明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力（×40）Fig.4 Migration abilities of cells in various groups detected by scratch assay（×40）

2.5 各組A549/DDP 細胞凋亡率對照組、aaptamine 組、DDP 組和聯合用藥組細胞凋亡率分別 為 （13.97±4.05）% 、（29.65±2.09）% 、（45.03±5.05）%和（56.40±2.95）%，與 對 照組、aaptamine 組和DDP 組比較，聯合用藥組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖5。

2.6 各 組A549/DDP 細 胞 中ABCG2 和ERCC1 蛋白表達水平及Bax/Bcl-2 比值與對照組、aaptamine 組和DDP 組比較，聯合用藥組細胞中ABCG2 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值明顯升高（P＜0.01）；與對照組比較，聯合組A549/DDP 細胞中ERCC1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖6 和表1。

圖5 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

圖6 Western blotting 法檢測各組細胞中ABCG2、ERCC1、Bcl-2 和Bax 蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of ABCG2，ERCC1, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

肺癌化療耐藥性的產生是一個多因素參與的復雜 過 程［16-18］。研 究［19-23］表 明：ABCG2 和ERCC1在肺癌耐藥細胞中高表達，并與鉑類耐藥有密切關聯。ABCG2 是ABC 轉運體家族內一種耐藥蛋白，可以將大部分化療藥物泵出細胞外，從而導致多藥耐藥現象的產生［24］。ERCC1 在核苷酸切除修復途徑中起到重要作用，是修復順鉑引起的DNA 損傷所必須的，其過表達與順鉑耐藥有密切關聯［24-25］。因此下調ABCG2 和（或）ERCC1 的表達，有利于逆轉DDP 耐藥，增強腫瘤細胞對DDP 的敏感性。

表1 各組A549/DDP 細胞中ABCG2 和ERCC1 蛋白表達水平及Bax/Bcl-2 比值Tab. 1 Expression levels of ABCG2 and ERCC1 proteins and ratios of Bax/Bcl-2 in A549/DDP cells in various groups

近年來，海洋天然產物在抗腫瘤新藥研發中越來越受到關注［26］，目前已有6 種被FDA 批準的該類 抗 腫 瘤 藥 物［27］。aaptamine 是aaptos 屬 海 綿 中 的特征性成分，前期研究［9-12，14］表明：aaptamine 對多種腫瘤細胞具有良好的抑制活性，但未見其與DDP 聯合用藥的相關研究報道。本研究結果顯示：aaptamine 與DDP 聯合用藥可明顯抑制A549/DDP細胞的增殖、克隆形成和遷移能力，并且通過增加凋亡相關蛋白Bax 和Bcl-2 表達水平的比例促進腫瘤細胞的凋亡；另外，聯合用藥組細胞中ABCG2蛋白表達水平較對照組和單獨用藥組均明顯下調，ERCC1 蛋白表達水平較對照組下調，表明聯合用藥抑制ABCG2 和ERCC1 的蛋白表達。 推測aaptamine 與DDP 聯合應用對A549/DDP 細胞具有協同抑制作用，其分子機制可能與抑制耐藥基因的表達有關，但其具體機制尚有待于進一步研究。

綜上所述，低濃度aaptamine 聯合低濃度DDP能明顯增強肺癌A549/DDP 細胞對DDP 的敏感性，兩藥聯合使用不僅提高了藥物治療效果，還可以減少單一藥物的使用劑量，進而減輕藥物的不良反應。本研究為逆轉DDP 耐藥提供了新思路。