人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)

徐寵俊, 何荷蕃, 林 群, 章 濤

（1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，福建 泉州 362000；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，福建 福州350005；3. 福建醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350004）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一種以神經(jīng)損傷、神經(jīng)興奮和傷害性神經(jīng)元過(guò)度活躍為特征的慢性疼痛狀態(tài)。目前臨床主要使用藥物治療，但效果并不理想。隨著對(duì)NP 所涉及的生物學(xué)過(guò)程的深入了解，新的治療方案也不斷出現(xiàn)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞占中樞神經(jīng)系統(tǒng)的70%，主要包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞2 種類型，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互作用在NP 發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用［1］。研究［2］顯示：小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素可通過(guò)抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而減輕慢性壓迫性損傷大鼠的NP，表明抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以減少嚙齒動(dòng)物的NP。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種來(lái)源于成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子。研究［3-6］顯示：HGF 具有促血管生成，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抗纖維化及抗細(xì)胞凋亡等功能。研究［7-8］表明：HGF 在體內(nèi)具有保護(hù)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元免受損傷及促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。最新研究［9］顯示：肌肉或鞘內(nèi)注射重組質(zhì)粒-HGF（pUDK-HGF）可以抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥反應(yīng)，通過(guò)外周或中樞機(jī)制減輕皮膚肌肉切開(kāi)牽拉誘導(dǎo)的疼痛行為。因此HGF有可能成為臨床上一種潛在的治療NP 的藥物。

裸質(zhì)粒注射由于不能長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)、在體內(nèi)濃度不高并可能引起排斥反應(yīng)等，限制其在臨床實(shí)驗(yàn)中的使用。近年來(lái)干細(xì)胞是各個(gè)學(xué)科研究的熱點(diǎn)，其來(lái)源豐富，移植排斥反應(yīng)少，且干細(xì)胞移植本身也對(duì)疼痛治療有潛在療效［10］。若將干細(xì)胞治療與重組HGF 高表達(dá)結(jié)合起來(lái)，將對(duì)疼痛的治療產(chǎn)生推動(dòng)作用。因此本研究構(gòu)建攜帶HGF 基因的慢病毒載體，并將慢病毒載體感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），以期為后續(xù)建立穩(wěn)定表達(dá)HGF 基因的BMSCs 細(xì)胞系，探討HGF 在NP 治療中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

SD 大鼠BMSCs 由福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院林群副教授惠贈(zèng)。人胚腎293T 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。pUC-HGF 質(zhì)粒由日本大阪醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心TOSHIKAZU NAKMUM 教授惠贈(zèng)，pNL-增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）慢病毒載體、包裝質(zhì)粒pHELPER 和包膜質(zhì)粒pVSVG 由福建醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室章濤教授惠贈(zèng)，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、SalⅠ、AseⅠ、NotⅠ、PvuⅠ、NheⅠ、AgeⅠ、SpeⅠ及Klenow 酶 和T4 DNA 連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB 公司，質(zhì)粒小量和中量抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司，核酸膠回收試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司，慢病毒濃縮試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biomiga 公司，胎牛血清、DMEM 和胰酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，ELISA 檢測(cè)試劑盒Immunis HGF EIA 購(gòu)自日本特殊免疫研究所，轉(zhuǎn)染及其他試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司。

1.2 pUC-HGF 質(zhì)粒酶切鑒定及測(cè)序

pUC-HGF 質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。選擇SalⅠ酶行酶切鑒定，酶切體系（20 μ L）：pUC-HGF 1 μ L，SalⅠ0.5 μL，10×Buffer3 2 μL，10×BSA 2 μL，ddH2O 14.5 μL。37 ℃酶切過(guò)夜后電泳觀察。鑒定后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

圖1 pUC-HGF 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of structure of pUC-HGF plasmid

1.3 慢病毒載體pNL-EGFP 質(zhì)粒酶切鑒定及測(cè)序

pNL-EGFP 質(zhì)粒圖譜及酶切位點(diǎn)見(jiàn)圖2。根據(jù)質(zhì)粒圖譜選擇NheⅠ酶進(jìn)行酶切鑒定。鑒定后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.4 重組慢病毒載體pNL-HGF-EGFP 的構(gòu)建及鑒定

1.4.1 目的基因片段的獲取SalⅠ單酶切獲取目的基因，電泳條帶相隔太近，不易切割回收目的基因，故尋找添加一個(gè)酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)既不存在目的基因片段上，又可以將pUC 19 載體骨架切割成小片段。基因測(cè)序結(jié)果顯示：AseⅠ酶切位點(diǎn)只存在于質(zhì)粒pUC-HGF 的pUC 19 載體骨架上，用SalⅠ酶和AseⅠ酶酶切pUC-HGF 質(zhì)粒獲取目的基因片段（包含SRα promoter啟動(dòng)子、HGF cDNA 序列及polyA 尾，該片段可完整表達(dá)HGF 基因）。SalⅠ和AseⅠ雙酶切體系（20 μL） 如下：pUCHGF 1 μL，SalⅠ0.5 μL，AseⅠ0.5 μL，10×Buffer3 2 μL，10×BSA 2 μL，ddH2O 14 μL。37 ℃酶切過(guò)夜后Klenow 酶補(bǔ)平黏性末端膠回收。

圖2 pNL-EGFP 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of structure of pNL-EGFP plasmid

1.4.2 慢病毒載體pNL-EGFP 線性化 基因測(cè)序結(jié)果及pNL-EGFP 質(zhì)粒圖譜顯示：pNL-EGFP 質(zhì)粒只存在1 個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn)（該位點(diǎn)可用于外源基因插入而不影響質(zhì)粒其他基因的表達(dá)），用XbaⅠ單酶切載體，酶 切 體 系（20 μ L）： pNL-EGFP 2 μL，XbaⅠ0.5 μL，10×Buffer2 2 μL，10×BSA 2 μL，ddH2O 13.5 μL。37 ℃酶 切 過(guò) 夜 后Klenow 酶補(bǔ)平粘性末端膠回收。

1.4.3 目的基因片段和載體連接 取上述酶切回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系（10 μL）：pUCHGF 酶切回收產(chǎn)物6 μL，pNL-EGFP 載體酶切回收產(chǎn)物2 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，T4 DNA 連接酶Buffer 1 μL。4 ℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，均勻接種在含有相應(yīng)濃度氨芐青霉素抗性的LB 培養(yǎng)板上，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

1.4.4 重組質(zhì)粒鑒定及基因測(cè)序 挑取若干個(gè)單菌落進(jìn)行質(zhì)粒小量提取電泳，根據(jù)電泳結(jié)果挑選疑似重組的質(zhì)粒，用PvuⅠ單酶切或者AgeⅠ+SpeⅠ雙酶切鑒定。前期基因測(cè)序結(jié)果顯示：pUC-HGF質(zhì)粒中只存在一個(gè)PvuⅠ酶切位點(diǎn)和SpeⅠ酶切位點(diǎn)，分別位于3 592 bp 片段中的396 bp 位點(diǎn)和896 bp 位點(diǎn)上； pNL-EGFP 質(zhì)粒中存在2 個(gè)PvuⅠ酶切位點(diǎn)，位于質(zhì)粒的7 527 bp 和8 475 bp 位點(diǎn)上；只存在1 個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn)和AgeⅠ酶切位點(diǎn)，分別位于質(zhì)粒中的2 397 bp 位點(diǎn)和2 945 bp 位點(diǎn)上。由于采用平端連接，目的基因插入的方向不定，無(wú)論目的基因是以正向插入還是反向插入，HGF 基因均可表達(dá)，因?yàn)槟康幕蚱魏芯幋aHGF 基因的完整的SRα promoter 啟動(dòng)子和polyA 尾，當(dāng)目的基因以正向插入XbaⅠ酶切位點(diǎn)時(shí)，經(jīng)PvuⅠ酶切可獲得948（2 個(gè)PvuⅠ酶 切 位 點(diǎn)8 475 bp 與7 527 bp 之差）、4 077 和8 326 bp 片段，當(dāng)目的基因以反向插入XbaⅠ酶切位點(diǎn)時(shí)，經(jīng)PvuⅠ酶切可獲得948 、5 526 和6 877 bp 片段；當(dāng)目的基因以正向插入XbaⅠ酶切位點(diǎn)時(shí)，經(jīng)AgeⅠ+SpeⅠ酶切可獲得3 280 和10 071 bp 片段，當(dāng)目的基因以反向插入XbaⅠ酶切位點(diǎn)時(shí)，經(jīng)AgeⅠ+SpeⅠ酶切可獲得1 480 和11 871 bp 片段。鑒定正確后送至生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，采用中量抽提試劑盒制備重組慢病毒載體。

1.5 慢病毒包裝及滴度測(cè)定

轉(zhuǎn)染前1～2 d，293T 細(xì)胞以6×106mL－1密度接種于直徑為10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照l(shuí)ipofectamine 2000使用說(shuō)明，pNL-HGF-EGFP（或pNL-EGFP） 與包裝質(zhì)粒pHELPER 及包膜質(zhì)粒pVSVG 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h 更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞上清液中的慢病毒顆粒并進(jìn)行濃縮，采用倍比稀釋法檢測(cè)病毒滴度。

1.6 慢病毒感染BMSCs

實(shí)驗(yàn)組用傳代至第3 代大鼠BMSCs 進(jìn)行感染，加入含感染復(fù)數(shù)（MOI） 為100 的pNL-HGFEGFP 慢病毒及感染增強(qiáng)劑聚凝胺的培養(yǎng)基，12 h更換培養(yǎng)基。同時(shí)以慢病毒pNL-EGFP 感染大鼠BMSCs 作為對(duì)照組。

1.7 RT-PCR 法檢測(cè)各組BMSCs 中HGF mRNA表達(dá)水平

根據(jù)GenBank 人HGF 基因序列設(shè)計(jì)合成引物：上 游 引 物5′-AAGATTGTTATC-GTGGGAATGG-3′，下 游 引 物5′-CCTATG-TTTGTTCGTGTTGGAA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為352 bp。設(shè)計(jì)并合成內(nèi)參GAPDH 引物：上游引物5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下 游 引 物5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng)度為496 bp。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別提取BMSCs 細(xì)胞RNA，進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共30 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖片，經(jīng)Band Scan 圖像分析軟件進(jìn)行吸光度（A）值掃描分析，以HGF 條帶A 值與內(nèi)參GAPDH 條帶A 值的比值表示HGF mRNA 表達(dá)水平。

1.8 ELISA 法檢測(cè)各組BMSCs 細(xì)胞上清中HGF蛋白水平

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組慢病毒分別感染大鼠BMSCs 48 h 后，收集上清，離心棄沉淀，將細(xì)胞上清稀釋20 倍后，用ELISA 試劑盒檢測(cè)HGF 蛋白濃度，于酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)490 nm 或492 nm 處讀取各孔的A 值，以A 值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的HGF 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的HGF蛋白水平可根據(jù)其A 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中HGF mRNA 表達(dá)水平和蛋白水平均符合正態(tài)分布，以表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pUC-HGF 質(zhì)粒酶切鑒定及基因測(cè)序結(jié)果

pUC-HGF 經(jīng)SalⅠ單酶切后，凝膠電泳獲得3 500 bp 的 片 段（包 含SR α promoter 啟 動(dòng) 子900 bp、 HGF cDNA 序 列2 300 bp 及polyA 尾300 bp） 和2 700 bp 的片段，見(jiàn)圖3。基因測(cè)序結(jié)果顯示：質(zhì)粒圖譜中人HGF cDNA 片段與GenBank （BC130286） 中人HGF 基因序列一致，且2 個(gè)SalⅠ酶切位點(diǎn)之間的序列長(zhǎng)度為3 592 bp，與質(zhì)粒圖譜中的3 500 bp 長(zhǎng)度大致相符，SalⅠ酶切位點(diǎn)與NotⅠ酶切位點(diǎn)間的300 bp 片段中含有基因轉(zhuǎn)錄的polyA 尾序列。

圖3 pUC-HGF 質(zhì)粒SalⅠ單酶切電泳圖Fig. 3 Electrophoregram of single enzymatic digestion of pUC-HGF plasmid by SalⅠ

2.2 慢病毒載體pNL-EGFP 質(zhì)粒酶切鑒定及基因測(cè)序結(jié)果

pNL-EGFP 質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ單酶切后，凝膠電泳獲得9 759 bp 片段（圖4）；基因測(cè)序結(jié)果顯示：pNL-EGFP 質(zhì)粒序列長(zhǎng)度為 9 759 bp，與pNL-EGFP 質(zhì)粒圖譜上標(biāo)注的序列長(zhǎng)度相符。

2.3 目的基因片段的獲取和重組質(zhì)粒篩選

pUC-HGF 質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和AseⅠ雙酶切后，凝膠電泳獲得3 592 bp 的片段（包含SRα promoter 啟動(dòng)子、HGF cDNA 序列及polyA 尾）（圖5）。pNLEGFP 質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ單酶切獲得9 759 bp 的載體片段（圖6）。挑取若干個(gè)單菌落進(jìn)行質(zhì)粒小量提取后電泳篩選重組質(zhì)粒（圖7）。

圖4 pNL-EGFP 質(zhì)粒NheⅠ單酶切電泳圖Fig. 4 Electrophoregram of single enzymatic digestion of pNL-EGFP plasmid by NheⅠ

圖5 pUC-HGF 質(zhì)粒SalⅠ和Ase Ⅰ酶切電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of doube enzymatic digestion of pUC-HGF plasmid by SalⅠand Ase Ⅰ

2.4 重組慢病毒載體pNL-HGF-EGFP 酶切鑒定和基因測(cè)序結(jié)果

圖6 pNL-EGFP 質(zhì)粒XbaⅠ單酶切電泳圖Fig. 6 Electrophregram of single enzymatic digestion of pNL-EGFP plasmid

圖7 重組質(zhì)粒pNL-HGF-EGFP 電泳圖Fig. 7 Electrophoregram of recombinant plasmid pNLHGF-EGFP

pNL-HGF-EGFP 重組慢病毒載體經(jīng)PvuⅠ單酶切或AgeⅠ和SpeⅠ雙酶切鑒定（圖8 和9），電泳圖中的條帶與預(yù)期計(jì)算的條帶大致相符，提示目的基因插入方向正確。圖8 中的11 871 bp 條帶距離標(biāo)準(zhǔn)條帶太遠(yuǎn)，可能是電泳上樣濃度過(guò)高或者電泳時(shí)間過(guò)短，為確保重組質(zhì)粒準(zhǔn)確性，將重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示目的基因插入的3 592 bp 片段與第一次pUCHGF 質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序的3 592 bp 片段序列完全一致。

2.5 pNL-HGF-EGFP 慢病毒感染293T 細(xì)胞感染效率和病毒滴度

圖8 重組質(zhì)粒pNL-HGF-EGFP PvuⅠ單酶切電泳圖Fig.8 Electrophoregram of single denzymatic digestion of recombinant plasmid pNL-HGF-EGFP by PvuⅠ

圖9 重組質(zhì)粒pNL-HGF-EGFP AgeⅠ和SpeⅠ雙酶切電泳圖Fig. 9 Electrophoregram of double enzymatic digestion of recombinant plasmid pNL-HGF-EGFP by AgeⅠand SpeⅠ

pNL-HGF-EGFP 感染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，感染48～72 h 細(xì)胞高表達(dá)綠色熒光蛋白（圖10）。采用倍比稀釋法檢測(cè)病毒滴度，在熒光顯微鏡下觀察并數(shù)出最后2 個(gè)熒光細(xì)胞克隆數(shù)，假設(shè)為X 和Y，則病毒滴度（TU·mL－1） = （X+Y×10）×1 000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）。對(duì)照組病毒滴度為1.2×107TU·mL－1，實(shí)驗(yàn)組病毒滴度為1.5×106TU·mL-1。

2.6 各組BMSCs 中HGF mRNA 表達(dá)水平

RT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖11。1 號(hào)泳道為對(duì)照組，未擴(kuò)增出條帶；3 號(hào)泳道為實(shí)驗(yàn)組，擴(kuò)增長(zhǎng)度與預(yù)期擴(kuò)增352 bp 的HGF 基因長(zhǎng)度相符合；2 和4 號(hào)泳道為內(nèi)參照GAPDH，擴(kuò)增長(zhǎng)度約496 bp，與預(yù)期相符。與對(duì)照組（0.177±0.055）比較，實(shí)驗(yàn)組BMSCs 中HGF mRNA 表達(dá)水平（4.934±0.098）明顯升高（P＜0.05）。

圖10 熒光顯微鏡觀察pNL-EGFP 和pNL-HGF-EGFP 慢病毒感染293T 細(xì)胞的形態(tài)（×10）Fig.10 Morphology of pNL-EGFP and pNL-HGF-EGFP lentivirus-infected 293T cells observed by fluorescence microscope(×10)

圖11 RT-PCR 法檢測(cè)各組BMSCs 細(xì)胞中HGF mRNA 表達(dá)電泳圖Fig. 11 Electrophoregram of expressions of HGF mRNA in BMSCs in various groups detected by RTPCR method

2.7 各組BMSCs 上清中HGF 蛋白水平

實(shí)驗(yàn)組BMSCs 上清中HGF 蛋白水平為（115.44±22.16） μg·L－1，較 對(duì) 照 組［（1.32+0.53）μg·L－1］明顯升高（P＜0.05）。

3 討 論

HGF 基因定位于人第7 號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，包含18 個(gè)外顯子和17 個(gè)內(nèi)含子，是一種雙鏈異二聚體結(jié)構(gòu)，由一條具有氨基尾端的發(fā)夾環(huán)及kringle 結(jié)構(gòu)的α 鏈和一條具有絲氨酸酶同源結(jié)構(gòu)域的β 鏈經(jīng)二硫鍵鏈接而成，其結(jié)構(gòu)中含有728 個(gè)氨基酸。HGF 的所有生物學(xué)活性均通過(guò)高親和力細(xì)胞表面受體c- MET 原癌基因介導(dǎo)。近年來(lái)，在坐骨神經(jīng)慢 性 縮 窄 性 損 傷 （chronic constriction injury，CCI）［11-12］和肌腱損傷［13］的臨床前模型中，HGF被證明可以減輕神經(jīng)性疼痛。另有研究［14-15］報(bào)道：HGF 治療可改善糖尿病患者神經(jīng)病變的臨床結(jié)果，降低疼痛評(píng)分，改善患者3 個(gè)月的生活質(zhì)量。臨床試驗(yàn)［16］表明：編碼人HGF 基因的裸質(zhì)粒pUDKHGF 能減輕嚴(yán)重肢體缺血（critical limb ischemia，CLI） 患者的疼痛。BAR? 等［17］在臨床上使用表達(dá)HGF 基因裸質(zhì)粒pIRES/VEGF165/HGF 治療CLI 患者，患者四肢注射pIRES/VEGF165/HGF耐受性良好，并降低了視覺(jué)模擬評(píng)分（visual analogue scale，VAS）值，提示pIRES/VEGF165/HGF 減輕了慢性皮膚創(chuàng)面引起的疼痛。因此，對(duì)HGF 在疼痛中作用的深入研究，可能為NP 尋找到可行的治療靶點(diǎn)。

間 充 質(zhì) 干 細(xì) 胞 （mesenchymal stem cell，MSC）是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的干細(xì)胞，可從骨髓、脂肪和臍帶血等組織中獲取。最近的研究［18-20］表明：全身或局部注射MSC可以減少促炎細(xì)胞因子的釋放，從而減輕NP。在嚙齒動(dòng)物疼痛模型的研究中，BMSCs 可緩解脊髓神經(jīng)結(jié)扎引起的機(jī)械和熱痛覺(jué)過(guò)敏［18］，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs） 可減輕非機(jī)械性糖尿病周圍神經(jīng)病變導(dǎo)致的NP［19］。研究［20-21］表明：BMSCs 不僅可以改善NP 的癥狀，還可以調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷引起的炎癥反應(yīng)，激活抗炎因子表達(dá)，阻止炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)，抑制疼痛進(jìn)展。

基因治療是一種新的、可行的治療疼痛的方法。非病毒和病毒載體已用于傳遞基因，編碼諸如內(nèi) 源 阿 片 類 藥 物［22］、生 長(zhǎng) 因 子［11］或 反 義RNA等［23］的候選治療藥物，直接將載體注射到目標(biāo)部位或周圍組織后，可減輕痛覺(jué)過(guò)敏和異常性疼痛。

鑒于HGF 和BMSCs 具有潛在緩解疼痛作用，本研究旨在構(gòu)建HGF 基因修飾的BMSCs，以實(shí)現(xiàn)基因與細(xì)胞治療相結(jié)合，為治療NP 提供更加有效的治療手段。如何將治療基因有效轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞組織中，使其以合適的水平表達(dá)，達(dá)到治療效果成為基因治療首要解決的問(wèn)題。慢病毒載體是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的基因運(yùn)輸工具，具有可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)移基因片段容量大，轉(zhuǎn)染效率高，可將目的基因整合到宿主基因組中，能夠長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)并且不易引發(fā)宿主免疫反應(yīng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。尤其是基于慢病毒載體的基因轉(zhuǎn)入CD34+造血干細(xì)胞（hemopoietic stem cell，HSCs） 已被應(yīng)用于多種遺傳病的治療，包括異色性白細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良［24］、維斯科特-奧爾德里奇綜合征［25］等，在上述試驗(yàn)中未報(bào)告與該載體相關(guān)的不良反應(yīng)。因此慢病毒載體成為理想的基因治療載體。

本研究選用自帶綠色熒光報(bào)告基因的pNLEGFP 為載體，獲取人HGF 基因序列后插入慢病毒表達(dá)載體，并在293T 細(xì)胞中包裝病毒，成功構(gòu)建含人HGF 基因的慢病毒表達(dá)載體pNL-HGFEGFP，通過(guò)感染BMSCs，證實(shí)該慢病毒載體能夠介導(dǎo)HGF 基因在BMSCs 內(nèi)正確表達(dá)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索疼痛相關(guān)疾病的基因-細(xì)胞聯(lián)合治療提供良好的基礎(chǔ)。