人早幼粒細胞cDNA 文庫中與GINS2 發生相互作用靶蛋白的篩選和鑒定

張 曦, 潘玉卿, 余 鑫, 鄭亞婷, 郭成斌, 徐 娜, 王良曉, 何 亮, 楊 麗

（1. 云南省腫瘤醫院 昆明醫科大學第三附屬醫院檢驗科，云南 昆明 650118；2. 昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科 云南省實驗診斷研究所 云南省檢驗醫學重點實驗室，云南 昆明 650032）

白血病是骨髓造血干細胞惡性克隆所形成的血液系統腫瘤。在全球范圍內，每年白血病的發病率和病死率約占所有病例的2.4%和3.2%［1］。在中國，白血病新發病例約為每年75.3/10 萬［2］。伴15 號染色體早幼粒細胞基因（ promyelocytic leukemia，PML） 和17 號染色體維甲酸受體基因（retinoic acid receptor alpha，RARα） 易位的急性早 幼 粒 細 胞 白 血 病 （acute promyelocytic leukemia，APL） 是急性髓細胞性白血病（acute myelocytic leukemia，AML）的一個特殊亞型，臨床上常見發熱、感染、貧血和細胞浸潤等急性白血病癥狀。在APL 形成過程中，融合蛋白PMLRARα 并非一成不變地始終作為一個整體來發揮致癌作用，其致白血病的分子機制仍不清楚。前期研究［3］表 明：GINS2 基 因 能 與 缺 失 核 定 位 信 號（nuclear localization signal，NLS） 的 變 異 蛋 白PML （NLS-） 在全細胞內共定位表達，提示GINS2 在單個細胞水平干擾了野生型PML 的正常功能并參與了APL 的發生發展。GINS2 基因作為GINS（go-ichi-ni-san2）家族成員之一，與真核細胞的DNA 復制及損傷有密切關聯，參與細胞周期的調控，并對細胞的增殖和凋亡起到關鍵作用［4］。目前國內外尚無關于GINS2 編碼蛋白與人早幼粒細胞cDNA 文庫互作蛋白篩選和鑒定的報道，為此本文作者使用前期構建成功的人早幼粒細胞cDNA文庫［5］和誘餌質粒pGBKT7-GINS2［6］，篩選出文庫內與GINS2 發生相互作用的靶蛋白，為進一步闡釋APL 發生的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器酵母雙雜交系統購自美國Clontech 公司，誘餌質粒pGBKT7-GINS2 和人早幼粒細胞cDNA 文庫由本實驗室前期成功構建，大腸桿菌Top10 由本室凍存。酵母菌小量提取試劑盒購自美國Solarbio 公司；質粒小抽試劑盒購自日本TaKaRa 公司；酵母營養缺陷型篩選培養基（包括SD/-Trp、SD/-TrP/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 培養基），酵母完全培養基（YPDA），大腸桿菌LB 培養基，氨芐青霉素（100 mg·L－1）和卡那霉素（50 mg·L－1）均購自上海碧云天生物技術有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。PCR 熱循環儀（美國Biorad 公司），臺式超高速低溫離心機和移液器（德國Eppendorf 公司），電轉化儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 文庫質粒的轉化及篩選從SD/-Trp 平板挑取單克隆菌落接種于50 mL 液體SD/-Trp 培養基中，30 ℃、225 r·min－1振蕩培養18 h 后，將菌液轉接至500 mL YDPA 培養基中，使初始600 nm 波長處吸光 度［A（600）］值 為 0.2。 繼 續30 ℃、225 r·min－1振蕩培養5 h 使A（600）為0.6。待菌液 恢 復 至 室 溫 后，4 000 r·min－1離 心5 min 回 收 菌體。然后迅速用30 mL 無菌水重懸菌體并混勻，4 000 r·min－1離心5 min后棄上清。再用0.1 mol·L－1醋酸鋰20 mL 重懸菌體，4 000 r·min－1離心5 min 后棄上清。 向離心管中依次加入50% 聚乙二醇PEG3350、1 mol·L－1醋 酸 鋰、30 μg pGBKT7-GINS2 和25 μg 文庫質粒。劇烈振蕩1 min 至完全混勻后，42 ℃水浴熱激25 min，然后轉入30 ℃水浴復蘇1 h。最終4 000 r·min－1離心5 min 回收菌體后，用8 mL 無菌水重懸菌體，吸取20 μ L 培 養物 經 梯 度 稀 釋（10、 100 和1 000 倍） 后 涂布SD/-Trp/-Leu 平板3 塊，用于檢測文庫轉化效率。其余涂SD/-Trp/-Leu/-His/+5 mmol·L－13-氨基-1，2，4-三氮唑（3-aminotriazole，3-AT） 平板50 塊。30 ℃培養4 d，觀察文庫質粒的轉化結果并記錄轉化效率。

1.3 陽性克隆報告基因的檢測行報告基因腺苷酸琥珀酸合成酶2（ADE2）和組氨醇氨基鹽轉移酶3（HIS3）檢測時，從篩庫平板中共挑取到15 個初始陽性克隆并接種至SD/-Trp/-Leu 平板中繼續培養3 d。將上述初始陽性克隆分別用無菌水稀釋后點種 至SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板，30 ℃培養4 d 后記錄平板的顯色結果。行報告基因β-半乳糖苷酶（LacZ）檢測時，另取一份無菌水重懸后的陽性克隆點于濾紙片上，然后將其徹底浸入液氮中，90 s 后取出室溫放置備用。將5 mL Z-buffer、70 μL X-gal 和24 μL β-巰基乙醇加入培養皿并混勻作為顯色液，將上述濾紙放入其中反應5 h 后記錄培養皿的顯色結果。

1.4陽性克隆的測序比對挑選通過報告基因檢測的10 個陽性克隆，將其分別轉入SD/-Trp/-Leu 液體培養基，振蕩過夜培養后采用酵母抽提試劑盒提取酵母質粒。將其轉化入大腸桿菌Top10 新鮮感受態進行擴增。最后將含有陽性克隆的Top10 轉化子放入含氨芐青霉素的LB 液體培養基擴增后提取質粒，并對質粒進行測序和基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對。

1.5 陽性克隆的回轉驗證將含有誘餌質粒pGBKT7-GINS2 的AH109 酵母菌作為受體菌制備感受態，分別將測序成功的8 個陽性克隆轉化其中并涂布SD/-Trp/-Leu 平板。挑取平板上長出的轉化子分別用無菌水稀釋后點種至SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板，30 ℃培養5 d 后對陽性克隆回轉驗證的ADE2 和HIS3 報告基因進行檢測并記錄平板顏色。另取一份用無菌水重懸后待驗證的8 個陽性克隆點于濾紙片上進行LacZ 報告基因的檢測并記錄平板顏色。

2 結 果

2.1 篩選文庫的轉化效率進行10、100和1 000倍梯度稀釋的SD/-Trp/-Leu 平板上分別生長1 672、208 和19 個菌落，總的文庫質粒轉化個數為 （1 672/20+208/2+19/0.2） ×1/3×8 000=7.53×105個，轉 化 效 率 為7.53×105/25 μg =3.01×104μg－1，完全滿足篩選要求（圖1）。

圖1 cDNA 文庫的轉化效率檢測Fig.1 Detection of transformation efficiency of cDNA library

2.2 陽性克隆ADE2、HIS3 和LacZ 報告基因的檢測ADE2 和HIS3 報告基因的檢測結果中，陽性對照在SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上均能正常生長，而陰性對照由于不能激活ADE2 和HIS3 報告基因，故在SD/-Trp/-Leu 平板上可以正常生長，但在缺乏組氨酸和腺嘌呤的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板上不能生長。在挑取到的15 個初始陽性克隆中，1、2、5、6、7、8、9、11、14 和15 等10 個 克 隆 能 在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板上生長，表明激活了HIS3 和ADE2報告基因，而3、4、10、12 和13 等5 個克隆則不能激活ADE2 和HIS3 報告基因（圖2A 和B）。此外，檢測報告基因LacZ 時，1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14 和15 等13 個克隆的由黃色變為綠色，表明其能激活LacZ 報告基因（圖2C）。

圖2 陽性克隆的ADE2、HIS3 和LacZ 報告基因檢測Fig.2 Detection of reporter genes of ADE2, HIS3 and LacZ of positive clones

2.3 陽性克隆的測序和比對將通過3 個報告基因檢測的10 個陽性克隆質粒進行測序，除8 和9 號克隆測序失敗，將其余8 個陽性克隆的測序結果通過美國國家生物信息中心的BALST 網站（https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi） 進 行 比 對，得到8 個陽性克隆分別屬于8 種不同的蛋白編碼基因，分別是：RNA 結合基序蛋白39 （RNA binding motif protein 39，RBM39），作為類固醇激素受體介導的轉錄和選擇性剪接；泛素樣修飾因子激活 酶1（ubiquitin-like modifier activating enzyme 1，UBA1），催化泛素偶聯的第一步且標記細胞蛋白降解；金屬硫蛋白2 （metallothionein-2，MT2A），主要控制細胞內鋅水平，影響凋亡和自噬途徑；線粒體鈣離子攝入蛋白1 （mitochondrial calcium uptake 1，MICU1），防止線粒體Ca2+超載而導致的細胞損傷及應激；N-乙基馬來酰亞胺敏感性融合蛋白輔因子（NSFL1 cofactor p47 isoform x3，NSFL1C），介導高爾基體片段再生所必需的蛋白；脂肪?；o酶A 還原酶1（fattyacyl-CoAreductase1，FAR1），主要作為脂肪酸轉化為脂肪醇所必需的蛋 白； 雙 特 異 性 磷 酸 酶 1 （dual specificity phosphatase 1，DUSP1），在絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK2） 信號途徑中發揮重要的生理功能；白細胞分化抗原14 （cluster of differentiation antigen 14，CD14），主要表達于單核/巨噬細胞表面且介導免疫反應。

2.4 陽性克隆的回轉驗證陽性克隆回轉驗證ADE2和HIS3報告基因時，菌液涂布SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板后，生長狀況良好且符合實驗要求。8 個陽性克隆中除6 號外，其余均能激活ADE2 和HIS3 報告基因（圖3A 和B）。而回轉驗證LacZ 報告基因時，8 種陽性克隆中除6 號外，其余均能激活LacZ 報告基因（圖3C）。

3 討 論

探尋白血病發病過程中的相關致病基因，對于減少放化療導致的基因突變具有重要意義，并可為白血病的臨床診治提供實驗室數據。在APL 發生發展過程中，盡管此類白細胞可被全反式維甲酸（all trans acid，ATRA）或砷劑誘導分化成熟，加之對白血病支持治療的改進，患者的生存率已有了明顯提高，但治療前不明原因發熱及完全緩解后因感染所致的高死亡率時有發生［7-10］。即使在發達國家，對復發難治性小兒白血病的治療效果仍不樂觀［11］。

由于變異蛋白PML（NLS-）在致APL 發病中與GINS2 基因存在關聯，本課題組前期研究［12］通過PCR 法檢測了GINS2 在白血病HL60、THP-1和U937 細胞株中的表達水平，結果顯示：GINS2在白血病細胞株中普遍高表達。本課題組在前期研究［13］中 構 建 了 針 對GINS2 基 因 蛋 白 編 碼 區（coding sequence，CDS） 的干擾序列，并靶向下調其在APL 細胞株HL60 中的表達，結果顯示：白血病細胞的增殖能力明顯受抑制且生長被阻滯在G2/M 期，相關的周期蛋白依賴性激酶1（cyclindependent kinases 1，CDK1） 和細胞周期蛋白B1（CyclinB1） 表達受到明顯抑制。本文作者推測：GINS2 可能通過上調人共濟失調毛細血管突變基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）、細胞周期檢測點激酶2 （cell cycle checkpoint kinase 2，CHK2） 及抑癌基因p53 的表達水平而發揮作用［14］。一系列的研究［12-14］表明：GINS2 作為促癌因子在APL 的發生發展中起到關鍵作用。為此，本文作者將構建成功的誘餌質粒pGBKT7-GINS2與人早幼粒細胞cDNA 文庫質粒共同轉化至酵母AH109 感受態細胞中，經過對篩選到的陽性克隆進行測序、比對和回轉驗證，成功在細胞中篩選到了8 個能與GINS2 發生相互作用的靶蛋白，進一步通過研究相互作用蛋白的生物學功能闡釋APL 的分子發生機制。

圖3 陽性克隆的回轉驗證Fig.3 Secondary transfection validation of positive clones

本研究所篩選到的8 個基因中，RBM39 是RNA 結 合 蛋 白 家 族 （RNA-binding proteins，RBPs）的成員之一，在真核生物中RBM39 表達的蛋白可以與大量核心剪切體蛋白共定位表達，并能在類固醇激素受體介導的轉錄和選擇性剪接中發揮重要作用［15］。研究［16］表明：RBM39 導致HOXA9靶基因的剪接改變，是AML 致病通路中所必需的一個重要轉錄網絡。RBM39 也能作為磺胺類藥物的作用靶點，為復發或難治性剪接體突變的AML患者提供有效的基因治療手段［17］。UBA1 作為催化泛素偶聯的起始酶標記蛋白質泛素化調節其降解，并參與DNA 的修復［18］，而且還可作為白血病和多發性骨髓瘤的治療靶點［19］。MT2A 是人金屬硫蛋白家族（metallothioneins，MTs） 成員之一，是一類低相對分子質量、富含半胱氨酸并可被金屬誘導的特異蛋白［20］。MT2A 的表達降低可下調細胞中鋅水平并影響細胞凋亡，還可通過下調B 淋巴細胞瘤-2 基因相關蛋白X （Bcl-2 associated X protein，BAX）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶9（caspase-9）和半胱氨酸蛋白酶12（caspase-12）等凋亡蛋白的表達而抑制細胞凋亡［21］。MICU1 作為線粒體鈣離子單項轉運體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）的亞基之一，對于線粒體基質內Ca2+的富集起到關鍵作用，而Ca2+作為細胞內重要信號分子，維持了細胞能量代謝、生長及增殖等多種功能［22］。而早幼粒細胞白血病蛋白PML 的功能失活直接導致了從內質網轉移到線粒體的Ca2+減少，進而引起了細胞凋亡增加和不可控的細胞增殖乃至持續的細胞自噬發生［23］。NSFL1C 又被稱為P47，是一種三聚體蛋白，能與P97 蛋白結合并介導高爾基體的有絲分裂和細胞再生［24］，在PML 敲除后的小鼠胚胎成纖維細胞中高表達，且對細胞黏附和遷移起到關鍵作用［25］。FAR1 可以將脂肪酸轉化為脂肪醇，這一過程是合成單酯和醚類脂類所必需［26］。DUSP1 所編碼的蛋白是一種具有酪氨酸和蘇氨酸雙重特異性的磷酸酶，可以將MAPKs/ ERK2 脫磷酸化，從而參與 細 胞 生 理 過 程［27］。DUSP1 在AML 患 者 及 細 胞系中的表達與酪氨酸激酶3 串聯重復序列有關聯［28］。CD14 分子主要在單核/巨噬細胞膜表面表達，能與其他蛋白質協同作用并介導對細菌脂多糖的先天免疫應答［29］。

綜上所述，本研究成功從人早幼粒細胞cDNA文庫中篩選到8 個能與GINS2 發生相互作用的靶蛋白，其有可能成為APL 診療的新靶點。