氯化兩面針堿通過JAK2/STAT3 信號通路對膠質瘤細胞上皮-間質轉化的抑制作用

賈茗博, 孫 瑩, 王 瑩, 宋燕珂, 趙麗艷

（吉林大學第二醫院檢驗科，吉林 長春130041）

膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤。盡管近年來采取外科切除、術后放療和化療等綜合性治療手段，但由于膠質瘤的高度侵襲性生長，患者術后腫瘤極易復發，預后較差，而上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 被認為是膠質瘤細胞侵襲性生長的重要機制之一［1-2］。因此，探索靶向干預膠質瘤細胞EMT 是當前膠質瘤治療的重要策略。 氯化兩面針堿（nitidine chloride，NC）是一種天然植物活性生物堿，主要來源于蕓香科植物兩面針的根，具有鎮痛、抗炎、抗瘧疾、抗真菌和抗血管生成等多種生物活性［3］。研究［4-5］顯示：NC 可以通過調控多種信號通路在人類惡性腫瘤中發揮作用，其中對兩面神激酶2/信號轉導及轉錄活化因子3 （Janus kinase signal transducers 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3） 信號通路的抑制作用比較突出。JAK2/STAT3 信號通路在惡性腫瘤的進展中起重要作用。NC 在多種腫瘤中均有抑制腫瘤細胞增殖和細胞發生EMT 的作用，但其對膠質瘤細胞EMT 的抑制作用及其機制目前尚未闡明。本研究探討NC 對人膠質瘤細胞EMT 過程的抑制作用及其可能的信號機制，為膠質瘤的臨床治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人膠質瘤U87 和LN18 細胞（美國ATCC 細胞庫）。NC （美國Apexbio 公 司），轉 化 生 長 因 子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）（美 國Peprotech 公司），DMEM 培養基（美國Gibco 公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（以色列Bioind 公司），二甲基亞砜（DMSO）、青霉素和鏈霉素（美國Sigma 公司），E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-連環蛋白和轉錄因子Snail、Slug、Twist1 以及STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）一抗（美國Cell Signaling Technology 公司），CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）。Transwell 小室（美國Corning 公司），細胞超凈工作臺和細胞恒溫培養箱（美國Thermo 公司），電泳儀和轉膜儀（北京龍方科技公司），酶標儀（美國Bio-Rad 公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細胞培養人膠質瘤U87 和LN18 細胞采用添加10% FBS、青霉素（100 U·mL－1）和鏈霉素（100 mg·L－1） 的DMEM 培 養 基，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。每2 d 更換1 次培養基，當細胞達80%～90%融合時采用胰酶-EDTA 消化液消化，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 CCK-8 法檢測細胞存活率準備好實驗所需試劑，向96 孔細胞培養板里加200 μL 培養基，調整細胞密度，保證每孔約8 000 個細胞，待細胞貼壁后，向膠質瘤U87 和LN18 細胞加入NC，使每孔NC 濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 和20.0 μmol·L－1，對照組加入等體積的培養基，放入培養箱。次日取出96 孔細胞培養板，每孔加入CCK-8 試劑20 μL，放入培養箱，繼續培養0.5 h。用酶標儀在波長450 nm 處測定每個孔的吸光度（A）值，細胞存活率=處理組A 值/對照組A 值×100%。

1.4 細胞分組U87 細胞分為對照組（不做處理）、EMT 組（加入10 μg·L－1TGF-β1 誘導膠質瘤U87 和LN18 細胞EMT）和不同濃度NC 組（分別采用2.5、5.0、7.5 和10.0 μmol·L－1NC 處理）。在采用STAT3 抑制劑WP1066 阻斷JAK2/STAT3通路實驗中，將U87 細胞分為對照組（不做處理）、EMT 組（加 入10 μ g·L－1TGF-β1 誘 導 膠 質 瘤細胞EMT） 和EMT+WP1066 處理組（加入10 μ g·L－1TGF-β1 和8 μmol·L－1WP1066）。

1.5 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移率U87 細胞以每孔1.5×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板，在37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。用1 mL的槍尖劃出3 條橫線，再劃出3 條垂直線。用PBS緩沖液洗去細胞碎片后換成無血清培養基，細胞分組及處理見“1.4”，每孔中隨機選出3 個視野，拍攝0 h 劃痕照片。繼續培養，于48 h 拍照記錄，測量不同時間劃痕寬度，計算細胞遷移率表示細胞遷移能力。細胞遷移率=（0 h 劃痕寬度－48 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。實驗重復3 次。

1.6 Transwell 侵襲實驗檢測細胞侵襲率將實驗所需槍尖和離心管放在冰盒中預冷處理，稀釋Matrigel 基質膠至工作濃度，每個Transwell 小室加60 μL，室溫放置8 h，固化培養基。接種細胞前水化基底膜。U87 細胞以5×104個/孔的密度接種到小室內，每孔加200 μL 無血清培養基，細胞分組及處理見“1.4”。聚甲醛固定，30 min 后用0.1%結晶紫染色15 min，PBS 緩沖液清洗染料，晾干。每個樣本隨機選取5 個視野，顯微鏡拍照記錄實驗結果。計數每個視野的穿膜細胞數，以細胞侵襲率表示細胞的侵襲能力。細胞侵襲率=實驗組穿膜細胞數/對照組穿膜細胞數×100%。

1.7 Western blotting 法檢測各組細胞中EMT 相關蛋白和JAK2/STAT3 通路相關蛋白表達水平U87 細胞分組及處理見“1.4”，收集細胞提取蛋白。每孔30 μg 蛋白樣品上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離。將蛋白轉到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，PBS 緩沖液漂洗，加入相應一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。隔天加入對應的二抗，室溫孵育2 h，取出后再次漂洗，配制ECL 顯色液，避光待用。將PVDF 膜置于凝膠成像分析儀中采集圖像加以分析，實驗重復3 次。利用Image J 軟件對蛋白條帶灰度值進行分析，以目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白表達水平。

1.8 統計學分析采用GraphPad Prism 7.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞遷移率、細胞侵襲率以及細胞中各種相關蛋白表達水平均以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，實驗重復3 次。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組膠質瘤U87 和LN18 細胞存活率不同濃度NC 處理U87 和LN18 細胞后各組細胞存活率均明顯降低，且隨著濃度的增加，其細胞存活率逐漸降低，見圖1。NC 處理U87 和LN18 細胞24 和48 h 后細胞存活率均明顯降低，處理48 h 后細胞存活率變化更明顯，此時的半數抑制濃度（IC50）為5.0～7.5 μmol·L－1。NC 濃度小于2.5 μmol·L－1時對細胞存活率無明顯影響，24 和48 h 時細胞存活率均在80%以上。因此，在后續實驗中選擇2.5、5.0、7.5 和10.0 μmol·L－1NC 為作用濃度，作用時間為48 h。NC 對U87 和LN18 細胞的抑制程度基本相同，故選擇U87 作為實驗細胞。

圖1 不同濃度NC 處理后各組膠質瘤U87 和LN18 細胞存活率Fig.1 Survival rates of glioma U87 and LN18 cell in various groups after treated with different concentrations of NC

2.2 各組膠質瘤U87 細胞遷移率與對照組比較，EMT 組U87 細胞劃痕距離明顯縮小，細胞遷移率明顯增加（P＜0.01）。與EMT 組比較，不同濃度NC組細胞遷移率明顯降低（P＜0.01）。見表1和圖2。

表1 各組膠質瘤U87 細胞遷移率和侵襲率Tab.1 Migration rates and invasion rates of glioma U87 cells in various groups (n=3,,η/%)

表1 各組膠質瘤U87 細胞遷移率和侵襲率Tab.1 Migration rates and invasion rates of glioma U87 cells in various groups (n=3,,η/%)

*P＜0.01 vs control group ；△P＜0.01 vs EMT group.

Group Control EMT NC（μmol·L－1）2.5 5.0 7.5 10.0 Migration rate 53.384±0.993 71.588±1.005*Invasion rate 100.000±0.000 150.594±7.209*86.002±7.534△72.584±8.697△30.461±2.387△9.419±1.381△19.951±2.086△18.122±1.505△12.722±1.528△13.265±0.617△

2.3 各組膠質瘤U87 細胞侵襲率與對照組比較，EMT 組細胞侵襲率明顯升高（P＜0.01）；與EMT 組比較，不同濃度NC 組細胞侵襲率明顯降低（P＜0.01），且呈濃度依賴性。見表1 和圖3。

2.4 各組膠質瘤U87 細胞中EMT 相關蛋白表達水平與對照組比較，EMT 組細胞中的上皮標志物E-鈣黏蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），而間質標志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環蛋白及誘導EMT 的轉錄因子Snail 和Twist1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與EMT 組比較，7.5 和10.0 μmol·L－1NC 組細胞中E-鈣黏蛋白明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），N-鈣黏蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），5.0、7.5 和10.0 μmol·L－1NC 組細胞中β-連環蛋白、波形蛋白及2.5、5.0、7.5 和10.0 μmol·L－1NC 組細胞中轉錄因子Slug、Snail 和Twist1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），NC 對誘導EMT 后的膠質瘤U87細胞中EMT 相關蛋白的抑制作用程度呈濃度依賴性。見圖4 和表2。

2.5 各組膠質瘤U87 細胞中JAK2/STAT3 信號通路相關蛋白表達水平與對照組比較，EMT 組細胞中JAK2 和p-JAK2 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），STAT3 和p-STAT3 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與EMT 組比較，5.0、7.5 和10 μmol·L－1NC 組細胞中JAK2、p-JAK2 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），2.5、 5.0、7.5 和10 μ mol·L－1NC 組 細 胞 中STAT3 和p-STAT3 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），且呈濃度依賴性。見圖5 和表3。

圖2 各組膠質瘤U87 細胞劃痕愈合實驗結果(×200)Fig.2 Results of scratch assay of glioma U87 cells in various groups (×200)

圖3 各組膠質瘤U87 細胞Transwell 侵襲實驗結果(×200)Fig.3 Results of Transwell invasion test of glioma U87 cells in various groups(×200)

2.6 STAT3 抑制劑WP1066 阻斷JAK2/STAT3通路實驗中各組膠質瘤U87 細胞中EMT 相關蛋白表達水平與對照組比較，EMT 組細胞中E-鈣黏蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-連環蛋白及轉錄因子Twist1、Slug 和Snail 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與EMT組比較，EMT+WP1066 組細胞中E-鈣黏蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-連環蛋白及轉錄因子Slug、Snail 和Twist1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），提示阻斷JAK2/STAT3 信號通路可以抑制膠質瘤EMT。見圖6 和表4。

圖4 各組膠質瘤U87 細胞中EMT 相關蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of EMTrelated proteins in glioma U87 cells in various groups

圖5 各組膠質瘤U87 細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3 蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of JAK2,p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 proteins in glioma U87 cells in various groups

表2 各組膠質瘤U87 細胞中EMT 相關蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of EMT-related proteins in glioma U87 cells in various groups （n=3，）

表2 各組膠質瘤U87 細胞中EMT 相關蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of EMT-related proteins in glioma U87 cells in various groups （n=3，）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs EMT group.

Group Control EMT NC（μmol·L－1）2.5 5.0 7.5 10.0 E-cadherin 1.00±0.00 0.78±0.04**N-cadherin 1.00±0.00 1.37±0.17*β-catenin 1.00±0.00 1.11±0.01**Vimentin 1.00±0.00 1.37±0.09**Slug 1.00±0.00 1.01±0.08 Snail 1.00±0.00 1.97±0.20**Twist1 1.00±0.00 2.04±0.19**1.38±0.14△△0.70±0.06△△0.59±0.03△△0.59±0.03△△0.68±0.07 0.83±0.03 0.93±0.06△1.21±0.10△△1.38±0.11 1.12±0.16 0.52±0.14△△0.34±0.09△△1.13±0.11 0.84±0.08△△0.43±0.04△△0.24±0.06△△1.17±0.11 0.93±0.07△△0.68±0.07△△0.67±0.08△△0.63±0.04△△0.49±0.08△△0.17±0.03△△0.14±0.04△△0.62±0.07△△0.62±0.04△△0.57±0.08△△0.52±0.06△△

表3 各組膠質瘤U87 細胞中JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 proteins in glioma U87 cells in various groups

圖6 WP1066 處理后各組膠質瘤U87 細胞中EMT 相關蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophorgram of expressions of EMT-related proteins in glioma U87 cells after treated with WP1066

3 討 論

已有研究［6-9］證明：NC 對肝癌、前列腺癌、卵巢癌和食管癌等多種腫瘤均有抑制作用。本研究首先檢測了NC 對膠質瘤細胞增殖活性的影響，結果顯示：NC 在體外可明顯降低膠質瘤U87 和LN18 細胞存活率，且呈濃度依賴性。

膠質瘤的重要特征是高度侵襲性生長，從而使腫瘤不斷生長并侵犯周圍的正常腦組織，造成膠質瘤手術治療難以徹底切除和易復發性［10］。最近的研究［11-12］表明：膠質瘤的高度侵襲性生長可能與細胞的EMT 過程有關，遏制膠質瘤細胞的EMT有望成為治愈腫瘤的有效手段。EMT 是一個復雜的生物過程，通過此過程，上皮細胞失去極性和細胞黏附，獲得間質細胞的運動性和侵襲性，與腫瘤的進展、侵襲及轉移有關［13］。同時，EMT 與腫瘤的復發和化療耐藥性有密切關聯［14-15］。EMT 的最主要特征是上皮標志物E-鈣黏蛋白表達下調，間質標志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環蛋白以及 轉 錄 因 子Snail、Slug 和Twist1 表 達 上 調［13］。EMT 的調控涉及很多因素，包括轉化生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、Wnt 信號通路和Notch 信號通路等［13］。研究［16-17］表明：NC 可以通過調控不同的信號通路抑制多種腫瘤的EMT過程。但NC 對膠質瘤細胞EMT 的抑制作用及其機制目前尚未闡明。本研究結果表明：在膠質瘤細胞EMT 時，NC 以濃度依賴的方式增加上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達，并降低間質標志物N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環蛋白以及轉錄因子Slug、Snail 和Twist1 的表達；通過劃痕愈合實驗和Transwell 侵襲實驗，證明NC 能有效抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲，揭示了NC 的抗轉移活性。說明NC 能夠抑制膠質瘤細胞的EMT 及其引起的細胞遷移和侵襲能力增強，從而延緩膠質瘤的進展。

JAK2/STAT3 信號通路參與細胞內許多重要的生物學過程，包括細胞增殖、遷移和侵襲以及免疫調節［5，18］。JAK2 激活會導致STAT3 的磷酸化，STAT3 與EMT 相關標志物的關系密切。在乳腺癌中，STAT3/Twist 通路參與CD146 介導的E-鈣黏蛋白表達的抑制［19］。在大腸癌中，STAT3 的過表達可明顯降低E-鈣黏蛋白的表達并增加N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達，STAT3 可能直接介導EMT 進程［20］。研究［21］表明：JAK2/STAT3 信號通路在腫瘤EMT 過程中發揮重要作用，上調JAK2/STAT3 通路活性可調控細胞的EMT 過程，在宮頸癌的轉移和侵襲中起關鍵作用。在口腔鱗狀細胞癌中，CC 趨化因子配體21（CCL21）/CC 趨化因子受體7 （CCR7） 軸可通過激活JAK2/STAT3 信 號 通 路 調 節EMT 進 程［22］。癌 相 關 成 纖維細胞可以通過JAK2/STAT3 信號通路分泌IL-6并促進TGF-β 介導的EMT，從而促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲［23］。NC 可 影 響JAK2/STAT3 信 號通路，在胃癌中，NC 可以通過抑制STAT3 DNA結合活性和JAK2/STAT3 信號通路進而抑制腫瘤的血管生成和腫瘤生長［24］。

表4 WP1066 處理后各組膠質瘤U87 細胞中EMT 相關蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of EMT-related proteins in glioma U87 cells in various groups after treated with WP1066（n=3，）

表4 WP1066 處理后各組膠質瘤U87 細胞中EMT 相關蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of EMT-related proteins in glioma U87 cells in various groups after treated with WP1066（n=3，）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs EMT group.

Group Control EMT EMT+WP1066 Twist1 1.00±0.00 2.01±0.07*0.87±0.06△E-cadherin 1.00±0.00 0.47±0.05*0.79±0.03△N-cadherin 1.00±0.00 1.57±0.06*1.07±0.16△β-catenin 1.00±0.00 1.29±0.04*0.90±0.05△Vimentin 1.00±0.00 1.25±0.07*0.72±0.04△Slug 1.00±0.00 1.43±0.08*0.57±0.05△Snail 1.00±0.00 2.29±0.10*1.53±0.05Δ

為了進一步闡明NC 抑制膠質瘤細胞EMT 的機制，本研究通過Western blotting 法檢測了膠質瘤細胞中JAK2/STAT3 通路蛋白表達水平，結果顯示：采用NC 處理后，JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達水平降低，且呈濃度依賴性。為了確認JAK2/STAT3 信號通路參與NC 抑制的膠質瘤細胞EMT，應用STAT3 抑制劑WP1066 抑制STAT3 活性來阻斷JAK2/STAT3 信號通路，結果表明：阻斷JAK2/STAT3 信號通路可明顯逆轉EMT 誘導的重要標志物E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白和β-連環蛋白以及轉錄因子Slug、Snail 和Twist1 的表達。本研究結果進一步證明：JAK2/STAT3 信號通路對于EMT 是必不可少的，而NC 抑制膠質瘤細胞EMT 的作用可能是通過影響JAK2/STAT3 信號通路實現的。

綜上所述，NC 通過JAK2/STAT3 信號通路抑制膠質瘤細胞的EMT 過程，并減弱細胞的遷移和侵襲能力。但將NC 應用于膠質瘤的臨床治療還需進行更多和更深入的研究。