3D 打印鈦合金種植體的制備及其骨結合性能

王 蕊, 李美華, 周萬琳

（吉林大學第二醫院口腔科，吉林 長春 130041）

3D 打印技術亦稱增量制造技術，是指將產品的數字模型文件先進行分層離散處理，然后通過激光照射等方式將金屬和樹脂等材料逐層疊加精確堆積構建該產品的空間結構［1-2］。選擇性激光燒結（selected laser sintering，SLS）是其中一種經典方式［3-4］，是在數控環境中利用激光燒結粉末材料，逐層疊加最終累積成形。近年來，種植技術逐漸成為牙齒缺失首選的治療方式，但是種植牙也存在材料價格昂貴和技術復雜等缺點，隨著3D 打印技術應用在口腔種植領域的發展，可以滿足種植牙的個性化要求，同時種植牙技術的發展越來越成熟，因而3D 打印種植體必將成為發展的趨勢。因優良的機械、化學性能和生物相容性，鈦（Ti）及鈦合金材料被作為生物種植材料廣泛應用［5］，其具有高強度-質量比、優越的耐腐蝕性、良好的生物相容性、耐久性、骨整合能力以及相對較低的彈性模量等優點，是醫學領域應用最為廣泛的材料，目前廣泛應用于牙種植體的是Ti-6Al-4V（TC4）［6-7］。盡管國外有大量關于3D 打印種植體臨床應用的研究［8-9］，但目前國內對于3D 種植體打印的臨床應用尚無相應、統一的指導意見，仍需要更多諸如3D 打印種植體長期負載或遠期生物學及機械并發癥相關的研究證據來支持3D 打印種植體的長期穩定性［10］，從而推動相關部門出臺標準或形成相應的指南，早日實現3D 打印種植體在國內外的臨床推廣與應用［11］。 本 研 究 通 過 對 比TC4 種 植 體 與 經 典Straumann 種植體骨結合性能的差異，以期為3D 打印種植體的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器6 月齡家兔由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供，動物使用許可證號：SYXK （吉） 2017-0003。飼養條件嚴格依照GB14925 進行，雌雄不限，體質量3.0～3.5 kg。Ti-6Al-4V ELI-0406 鈦合金粉末（上海艾荔艾金屬材料有限公司），Micro-90 清洗劑（上海上碧實驗儀器有限公司），Straumann?種植體（吉林省圣諾商貿有限公司），75%酒精消毒液和名碘皮膚黏膜消毒液（山東利爾康醫療科技股份有限公司），生理鹽水（石家莊四藥有限公司），水合氯醛溶液和中性甲醛固定液（北京雷根生物技術有限公司），注射用五水頭孢唑林鈉（深圳華潤九新藥業有限公司），亞甲基藍-酸性品紅染色液（上海源葉生物科技有限公司），甲苯胺藍染色液（北京華越洋生物科技有限公司）。EinScan-Pro+多功能手持式3D 掃描儀（杭州先臨三維科技股份有限公司），RENISHAW AM250 金屬增材制造系統（深圳智誠三維網絡有限公司），Solid Works 2012 建模軟件（美國Solid Works 公司），FEI Scios 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（賽默飛世爾科技有限公司），超聲波清洗機和海德曼風冷滅菌器（吉林大學第二醫院），NSK Surgic XT Plus 標準種植機（上海麥森醫療科技有限公司），Straumann?手術工具盒（吉林省圣諾商貿有限公司），YX932D 負壓吸引器（上海五相儀器儀表有限公司），KD-BM Ⅱ電腦生物組織包埋機、Leica RM224 半自切片機、OLYMPUS BX51 金相顯微鏡、OLYMPUS DP73 數碼顯微照相裝置和OLYMPUS cellSens 顯微圖像軟件（吉林大學病理生物學教育部重點實驗室提供），HH-2 數顯恒溫水浴鍋（常州天瑞儀器有限公司），

1.2 TC4 種植體的制備采用本課題組前期實驗方 法 制 備TC4 種 植 體［12］。將Straumann 組 織 水 平種植體（4.1 mm×10.0 mm） 置于白光LED 燈下，選擇固定式自由掃描模式，使用EinScan-Pro+多功能手持式3D 掃描儀對Straumann 種植體實現逆向掃描，將掃描結果輸出為STL 格式文件，建立原始數字模型。之后依照設計需要運用Solid-Works 2012 建模軟件對原始數字模型進行表面修飾、結構優化和圖形片切等處理，獲得最終數字模型，保存為STL 格式文件備用。將儲存有最終數字模型信息的STL 格式文件導入RENISHAW AM250 金屬增材制造系統，讀取數據后，以Ti-6Al-4V ELI-0406 鈦合金粉末為底料進行打印。打印參數設置為高純度氬氣、層厚50 μm 和激光強度200 W 進行燒結，共打印30 個種植體試件（TC4 種植體）。成形的種植體清潔余留鈦粉，噴砂去除結構缺陷，依次使用Micro-90 清洗劑、75%酒精及蒸餾水超聲波震蕩清洗10 min，最后高溫高壓消毒備用。

1.3 家兔雙側股骨區種植體模型建立“1.2”中制備的TC4 種植體為實驗組（TC4 種植體組），Straumann 種植體為對照組（Straumann 種植體組），在6 只家兔雙側股骨區建立種植體模型，每側股骨均植入1 顆TC4 種植體和1 顆Straumann 種植體，共植入12 顆TC4 種植體和12 顆Straumann種植體，并設置觀察時間點為術后2、4 和8 周，預計每個時間點處死2 只家兔。

1.4 標本的固定和脫鈣NaH2PO44 g、Na2HPO46.5 g 及37%甲醛100 mL，蒸餾水溶解后定容至1 L，配制為10%中性甲醛溶液。甲酸100 mL，蒸餾水混勻后定容至1 L，配制為10%甲酸溶液。分別取等量10%中性甲醛溶液與10%甲酸溶液均勻混合，配制為10%甲酸-中性緩沖甲醛脫鈣液，現配現用。于術后2、4 和8 周采用過量麻醉法分別處死家兔，暴露股骨上段，完全清理骨面附著的軟組織后，截取種植體周圍0.5 cm 范圍以內硬組織制成標本，立即置入10% 中性甲醛溶液，固定1 周。固定完成后，流動水漂洗4 h，按照標本與脫鈣液1∶30 的體積比，將骨塊置入10%甲酸-中性緩沖甲醛脫鈣液內脫鈣，脫鈣液更換周期為48 h，直至針刺入硬組織時阻礙明顯減小，即標志脫鈣完成。常規包埋切片，備用。

1.5 甲苯胺藍染色檢測2 組種植體骨結合界面新骨形成及骨組織修復情況切片脫蠟至水： 二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次脫蠟40 min；系列乙醇浸潤水化：無水乙醇2 次，每次10 min；95% 乙醇2 次，每次5 min；80%乙醇1 次5 min。蒸餾水水洗2 次。浸染于甲苯胺藍工作液中30 min；蒸餾水沖洗3 min；0.5%冰乙酸工作液分化，至細胞核和顆粒清晰可見；切片脫水、透明和封片：95%乙醇快速脫水；無水乙醇脫水2 次，每次5 min；二甲苯透明2 次，每次10 min；中性樹膠封固切片。鏡下觀察2 組種植體骨結合界面新骨形成及骨組織修復情況。

1.6 亞甲基藍-酸性品紅染色檢測2 組種植體骨結合界面新生骨形成和礦化情況切片脫蠟至水（同甲苯胺藍染色）；60℃水浴環境下亞甲基藍工作液浸染15 min，濾紙吸盡余留工作液；60℃蒸餾水漂洗1 min，干燥；加入酸性品紅工作液浸染5 min，濾紙吸盡余留工作液；切片脫水、透明和封固（同甲苯胺藍染色）。鏡下觀察2 組種植體骨結合界面新生骨和礦化骨情況。

1.7 術后TC4 種植體穩定性和生物相容性檢測術后TC4 種植體取出后，進行干燥處理，采用離子濺射鍍膜機噴金后，利用SEM 對種植體表面微觀形貌進行觀察，同時使用能量色散X 射線光譜儀（energy-dispersive x-ray spectroscopy，EDS）對TC4 種植體進行元素構成分析。

2 結 果

2.1 術后不同時間點2 組種植體骨結合界面新生骨形成及骨組織修復情況術后2 周，高倍鏡下可見2 組緊貼種植體的骨組織邊緣有胞核深染、胞漿呈淡藍色的成骨細胞線性排列，未觀察到明顯的新骨形成。術后4 周，2 組種植體骨組織邊緣均可觀察到淡染的新生膠原纖維樣結構，排列欠整齊，與原礦化骨組織界限不清。術后8 周，2 組靠近種植體一側骨組織均有淡藍色的新生類骨質形成，結構連續完整，內含大量骨細胞，與原礦化骨界限清晰。見圖1。

2.2 術后不同時間點2 組種植體骨結合界面新生骨形成及礦化情況術后2 周，Straumann 種植體組種植體-骨組織界面可見因種植外科手術切割形成的骨缺損，2 組近種植體側的骨接觸面上可見胞核深染成藍色的成骨細胞。術后4 周，2 組種植體與原礦化骨組織間均可見新形成且紅染的類骨質結構。術后8 周，2 組種植體表面均可見深紅色的新生骨組織，伴有一定程度的鈣化形成，Straumann 種植體組鈣化程度略優于TC4 種植體組，紅染的原礦化骨與深紅染的新生骨界限相對模糊。見圖2。

圖1 術后不同時間點2 組種植體骨結合界面骨組織甲苯胺藍染色結果（×400）Fig.1 Results of toluidine blue staining of osseointegration interface bone tissue of implants in two groups at different time points after operation（×400）

2.3 術后TC4 種植體的穩定性和生物相容性術后8 周時，SEM 觀察顯示：完成體內實驗的TC4種植體表面結構基本與術前TC4 種植體保持一致［12］，低倍鏡視野下可見種植體表面無明顯結構缺陷，散在分布有較大的孔隙結構；高倍鏡視野下可見種植體表面存在致密的片層狀結構及相互連通的孔隙結構（圖3A）。EDS 掃描結果和元素分布結果顯示：完成體內實驗的TC4 種植體除含有與術前TC4 種植體［12］一致的Ti、鋁（Al）、礬（V）、鐵（Fe）、碳（C）和氧（O）等元素外，尚有常量元素鈣（Ca）、錳（Mg）和微量元素硅（Si）散在分布于種植體表面（圖3B 和圖4）。

3 討 論

目前普遍認為，支架材料最有利于新生骨再生形成的孔隙大小范圍為200～1 000 μm［8-13］，傳統技術通常難以控制種植體表面形成的孔隙大小和與孔隙率，且傳統制造工藝成本高、效率低且性能差，已不能滿足日益增長的醫學種植體的需求。隨著3D 打印技術的發展，現有的技術手段能夠精確孔隙尺寸的形成，獲得梯度孔隙率的多孔表面。

圖2 術后不同時間點2 組種植體骨結合界面骨組織亞甲基藍-酸性品紅染色結果（×400）Fig. 2 Results of methylene blue-acid fuchsin staining of osseointegration interface bone tissue of implants in two groups at different time points after operation（×400）

圖3 術后8周TC4種植體表面SEM(A)和EDS掃描圖像（×10 000）Fig. 3 Pictures of SEM(A) and EDS scaning of TC4 implant surface at 8 weeks after operation (×10 000 )

圖4 術后8 周TC4 種植體的EDS 分析Fig. 4 EDS analysis of TC4 implants at 8 weeks after operation

YU 等［14］采用3D 打印技術，制備了具有起伏宏觀粗糙表面的Ti-6Al-4V 種植體，骨髓間充質干細胞在3D 打印種植體表面的黏附、增殖、成骨分化和血管生成因子表達水平均高于傳統加工方法獲得的種植體，體內研究也顯示3D 打印種植體在早期表現出相對較好的骨整合性能，表明3D 打印鈦合金具有良好的生物相容性、骨傳導性和血管生成潛能，有望作為骨植入材料，與本實驗結果有一致性。

組織學特殊染色法主要包括甲苯胺藍染色法、亞甲基藍-酸性品紅染色法和Masson 染色法等，合適的染色法可以顯示骨成熟狀態和骨組織各種分化狀態［15］。本研究結果顯示：術后2 周時，經甲苯胺藍染色和亞甲基藍-酸性品紅染色可觀察到緊貼種植體的骨創邊緣聚集有胞核深染、單層排列的成骨細胞，TC4 種植體組成骨細胞數量略少于Straumann 種植體組，雖然未見明顯的骨質形成，但成骨細胞的募集展示了TC4 種植體和Straumann種植體周圍均存在活躍且一致的成骨趨勢，提示種植體周圍骨修復進入所謂的骨傳導階段［16］，與BUSER 等［17］的研究結果相符合；術后4 周時，鏡下觀察到活躍的類骨質結構形成是這一時期的共同特征，而甲苯胺藍染色亦可觀察到淡染的新生膠原纖維樣結構，排列欠整齊，與原礦化骨組織邊界不清，可認為種植體周圍骨修復已進入新生骨形成階段［16］；術后8 周時，種植體周圍骨修復開始進入緩慢的骨重建階段［16］，甲苯胺藍染色可在近種植體一側觀察到淡藍色且連續完整的新生骨組織，新生骨與原礦化骨邊界清晰，而亞甲基藍-酸性品紅染色則可見2 組種植體表面均有深紅色的新生骨組織形成，但與紅色的原礦化骨組織界限模糊，新生骨組織內伴有一定程度的鈣化形成，可見有部分位點形成板層骨，且Straumann 種植體組在鈣化程度上相對優于TC4 種植體組。本研究結果顯示：TC4種植體植入家兔體內8 周后，SEM 掃描可見其表面結構與術前基本保持一致，高倍鏡下仍可見種植體表面存在致密的片層狀結構及相互連通的孔隙結構，提示SLS 技術成形的TC4 種植體具備優越的結構穩定性，術后8 周時在TC4 種植體和周圍骨組織之間已顯示出非常好的骨整合。亦有學者［18-19］提出不同理論，認為鈦合金尤其是TC4，具有嚴重的生物惰性和釋放Al 和V 等金屬離子，影響骨愈合過程，為克服這些問題，可以進行表面改性等處理。

綜上所述，3D 打印技術制備的TC4 種植體具備優越的結構穩定性和良好的生物相容性，并能夠在體內形成與經典種植體一致且相近的種植體-骨結合能力，3D 打印技術是一種具有良好發展前景的新技術。