痰熱清注射液對阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征大鼠外周血T 淋巴細胞亞群的影響

薛 靜, 劉志明, 吳永鋒，董凱峰，王慶豐，祖金美，張海靜，駱 彬,孔祥苓

（河北醫科大學第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，河北 石家莊 050031）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是一種常伴有睡眠結構紊亂、打鼾、頻繁發生血氧飽和度下降和白天嗜睡等癥狀的疾病，由睡眠上氣道塌陷阻塞引起呼吸暫停和通氣不足［1］。OSAHS 容易引起組織器官缺血和缺氧，甚至導致多器官和系統功能不全或障礙，其發病機制復雜，至今尚未完全明確［2-3］。研究［4-5］表明：特征性的慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）引起的氧化應激反應和機體炎癥反應是OSAHS 的重要致病機制之一。OSAHS 屬于中醫學“嗜臥”范疇，證見脾虛濕困，常以燥濕化痰、開竅醒神為治療原則［6］。痰熱清注射液由黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹組成，具有化痰、清熱和扶正功效，目前臨床常用于心肺疾病的治療［7-8］。 目前國內外尚無痰熱清注射液對OSAHS 患者T 淋巴細胞亞群影響方面的研究。本研究采用間歇低氧方法建立OSAHS 大鼠模型，觀察痰熱清注射液對OSAHS 模型大鼠T 淋巴細胞亞群和細胞炎癥因子的影響，為闡明痰熱清注射液治療OSAHS 的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF 級雄性SD大鼠40 只，3 月齡，體質量（230±30）g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（冀）2013-0023。大鼠適應性飼養1 周，飼養條件：室溫26 ℃±2 ℃，相對濕度45%～55%，自由進水和攝食。 小鼠抗大鼠CD3+FITC、CD4+R-PE 和CD8+R-PE（美國Caltag 公司）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素6（interleukin- 6，IL-6）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒（美國TPI 公司）。痰熱清注射液由上海凱寶藥業股份有限公司提供，主要成分為黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花和連翹，規 格 10 mL/支 ，國 藥 準 字 Z20030054。FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國BD 公司，MR-96A 全自動酶標儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.2 OSAHS 動物模型的建立［9］造模大鼠置于間歇性低氧艙，循環給予氮氣和氧氣，每循環120 s充入氮氣使艙內最低氧濃度為6%～8%，維持40 s（OSAHS 呼吸暫停所規定為10 s），緩慢充入氧氣至21%，維持80 s，每天8 h。實驗過程中艙內溫度為19 ℃～22 ℃，濕度為38%～52%，產生的CO2和H2O 分別用鈉石灰和無水氯化鈣吸收。對照組大鼠同時置于相同規格的有機玻璃倉內，無缺氧處理過程。采集大鼠動脈血進行血氣分析，作為模型建立成功的判斷標準，模型大鼠最低血氧分壓為37.5 mmHg，血氧飽和度為59.3%，符合人類OSAHS 的診斷標準。

1.3 實驗動物分組及給藥50 只雄性SD 大鼠隨機分為對照組，模型組，低、中和高劑量痰熱清注射液組，每組10 只。模型組，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠進行造模處理，造模第1 天開始，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠分別靜脈注射給予0.9、1.8 和3.6 mL·kg－1痰熱清注射液，大鼠給藥劑量根據成人給藥劑量按體表面積換算，大鼠每日等效劑量（g·kg－1） =6.3×成人每日劑量（g·kg－1）。對照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。連續給藥14 d。

1.4 大鼠胸腺指數和脾臟指數的測定大鼠取血后頸椎脫臼處死，無菌條件下取胸腺和脾臟，洗滌后用濾紙吸干，稱質量，計算臟器指數：臟器指數=臟器質量（mg）/體質量（g）。

1.5 MTT 法檢測大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖活性取大鼠脾臟，制備脾細胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養液調整細胞濃度為1×108L－1的單細胞懸液，將細胞接種于24 孔細胞培養板內，加入經RPMI 1640 完全培養液配制的ConA（終濃度為5 mg·L－1），每個樣品設3 復孔，5%CO2、37 ℃培養72 h，加入MTT，培養結束時棄上清加入二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，490 nm 處測定吸光度（A）值，以A 值表示大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖活性。

1.6 流式細胞術檢測大鼠外周血中不同T淋巴細胞亞群百分率各組大鼠于實驗第15 天經腹主動脈收集肝素抗凝血液，4℃、3 000 r·min－1離心15 min 分離淋巴細胞，制備成密度為1×107mL－1的細胞懸液，分別取細胞懸液100 μL（含1×106個細胞），分別加入CD3、CD4 和CD8 抗體，4 ℃避光孵育15 min，加入PBS 緩沖液1 mL 洗滌5 min，置于2 500 r·min－1離心5 min，棄去上清液，于沉淀細胞內加入100 μL PBS 緩沖液，混勻，1 h 內采用流式細胞儀檢測不同T 淋巴細胞亞群百分率。

1.7 ELISA 法 檢 測 大 鼠 血 清 中TNF-α 和IL-6 水平大鼠腹主動脈采血后，分離血清，采用ELISA 法檢測大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平，操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.8 統計學分析采用SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠脾臟指數和胸腺指數，脾臟T 淋巴細胞增殖活性，外周血中CD4+T 淋巴細胞百分率、 CD8+T 淋巴細胞百分率和 CD4+/CD8+T 淋 巴 細 胞 比 值，血 清 中TNF-α 和IL-6 水平，均符合正態分布，均以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠脾臟指數和胸腺指數與對照組比較，模型組大鼠脾臟指數和胸腺指數明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠脾臟指數和胸腺指數明顯升高（P＜0.05）；低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠脾臟指數和胸腺指數組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖活性與對照組比較，模型組大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖活性明顯升高（P＜0.05）；與低劑量痰熱清注射液組比較，高劑量痰熱清注射液組大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖活性明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠脾臟指數和胸腺指數Tab. 1 Spleen indexes and thymus indexes of rats in various groups (n=10,)

表1 各組大鼠脾臟指數和胸腺指數Tab. 1 Spleen indexes and thymus indexes of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model Tanreqing Injection Low dose Medium dose High dose Spleen index 2.81±0.57 1.48±0.35*Thymus index 1.06±0.15 0.32±0.08*0.44±0.09△0.51±0.08△0.53±0.11△1.77±0.45△1.82±0.37△2.06±0.52△

表2 各組大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖活性Tab. 2 Proliferation activities of T lymphocytes of rats in various groups (n=10,)

表2 各組大鼠脾臟T 淋巴細胞增殖活性Tab. 2 Proliferation activities of T lymphocytes of rats in various groups (n=10,)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Tanreqing Injection group.

Group Control Model Tanreqing Injection Low dose Medium dose High dose A value 0.32±0.04 0.20±0.02*0.24±0.03△0.27±0.04△0.29±0.03△#

2.3 各組大鼠外周血中不同T 淋巴細胞亞群百分率與對照組比較，模型組大鼠外周血中CD4+T 淋巴細胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細胞比值明顯降低（P＜0.05），CD8+T 淋巴細胞百分率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠外周血中CD4+T 淋巴細胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細胞比值明顯升高（P＜0.05），CD8+T 淋巴細胞百分率明顯降低（P＜0.05）；低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠外周血中不同T 淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細胞比值組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1 和表3。

2.4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量痰熱清注射液組比較，中和高劑量痰熱清注射液組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

圖1 各組大鼠不同T 淋巴細胞亞群流式散點圖Fig.1 Flow scatter diagram of T lymphocyte subsets of rats in various groups

表3 各組大鼠外周血中不同T 淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細胞比值Tab. 3 Percentages of different T lymphocyte subsets in peripheral blood and CD4+/CD8+T lymphocyte ratios of rats in various groups （n=10，x±s）

表4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10，，ρB/（ng·L-1）］

表4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10，，ρB/（ng·L-1）］

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Tanreqing Injection group.

Group Control Model Tanreqing Injection Low dose Medium dose High dose TNF-α 75.31±5.62 138.06±27.81*IL-6 44.59±6.85 144.05±32.46*87.32±11.83△70.34±9.20△#64.89±7.09△#107.72±15.80△93.41±11.36△#89.57±10.31△#

3 討 論

OSAHS 最主要的3 個病理特征為間歇性低氧血癥或高碳酸血癥、上氣道阻塞引起的胸腹式反常呼吸及缺氧時睡眠覺醒引起的睡眠結構的紊亂［10］。目前OSAHS 動物模型主要以上述特征為依據構建。本研究主要通過給予大鼠間歇低氧模擬OSAHS 睡眠中發生慢性低氧病理生理過程。本研究結果顯示：模型組大鼠脾臟指數和胸腺指數降低，CD4+/CD8+比值降低，血清中TNF-α 和IL-6水平升高，說明間歇低氧可影響大鼠外周血T 淋巴細胞亞群，導致免疫功能異常，促進細胞炎性因子大量釋放，嚴重損傷內皮細胞功能，與有關研究報道［11］結果一致。另有研究［12］表明：低氧低壓處理14 d 對大鼠免疫功能的影響最為明顯，同時14 d為痰熱清注射液1 個療程，因此本次實驗采用連續14 d 給藥。

胸腺是機體的中樞免疫器官，是淋巴細胞增殖的重要場所，而脾臟是機體的外周免疫器官，是T 淋巴細胞發揮免疫作用的場所。本研究結果顯示：間歇性低氧處理導致大鼠胸腺和脾臟指數明顯降低，表明其對機體造成免疫損傷；低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠胸腺指數和脾臟指數升高，表明痰熱清注射液對低氧所致的大鼠免疫功能異常有一定保護作用。T 淋巴細胞維持機體免疫功能，CD3 為T 淋巴細胞的標志，分為CD4+T 淋巴細胞亞群和CD8+T 淋巴細胞亞群，二者間互相協調［13-14］，CD4+/CD8+T 淋 巴 細 胞 比 值 通 常 作 為 機體 免 疫 平 衡 的 評 價 指 標［15］。研 究［16-17］表 明：OSAHS 患者體內存在系統性炎癥反應，與健康人比較，OSAHS 患者血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高。另有研究［18］顯示：TNF-α 和IL-6 是介導患者白天嗜睡的細胞炎性因子。TNF-α 和IL-6 由單核-巨噬細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞等多種細胞產生，在炎癥、宿主防御和組織損傷中有著廣泛的體液和細胞免疫作用，兩者均有促進動脈粥樣硬化、引發胰島素抵抗的作用，進而導致OSAHS患者機體各器官組織功能損害，發生OSAHS 相關性全身疾病［19-20］。

痰熱清注射液是一種具有清熱祛痰、驅邪扶正作用的中藥制劑，目前臨床上主要用于呼吸道疾病的治療。研究［21］表明：痰熱清注射液具有改善缺氧及二氧化碳潴留、降低慢性阻塞性肺疾病患者外周血炎癥因子的作用。本研究結果顯示：低、中和高劑量痰熱清注射液組大鼠外周血中CD4+T 細胞百分率和CD4+/CD8+T 淋巴細胞比值升高，CD8+T 細 胞 百 分 率 降 低，血 清 中TNF-α 和IL-6 水平降低，表明痰熱清注射液能夠有效調節T 淋巴細胞亞群平衡，抑制細胞炎性因子分泌，與有關研究報道［22］一致。

綜上所述，痰熱清注射液治療OSAHS 具有一定療效，可通過調節T 淋巴細胞亞群平衡、抑制細胞炎性因子，進而改善大鼠的免疫功能。