五倍子酸通過調節人肝癌HepG-2 細胞線粒體氧化磷酸化對細胞凋亡的誘導作用

張海英, 張文馨, 趙文靜, 李 偉

（1. 吉林大學基礎醫學院 病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春 130021；2. 吉林省肝膽病醫院中心實驗室，吉林 長春 130062）

哺乳動物細胞可通過線粒體氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS） 和糖酵解2 種糖代謝方式供應能量ATP，常氧情況下，正常細胞糖代謝主要由線粒體OXPHOS 產生ATP 以提供代謝活動所需要的能量。WARBURG 等［1］認為：腫瘤細胞由于線粒體呼吸缺陷，即使在有氧環境中也通過糖酵解供應大部分ATP。但近期研究［2-4］表明：多數腫瘤細胞線粒體是完整的，即使有些細胞具有更高的糖酵解，但仍保持線粒體呼吸，在某些癌癥（包括白血病、淋巴瘤、胰腺導管腺癌、高OXPHOS 亞型黑色素瘤、子宮內膜癌和高侵襲性腫瘤等）中線粒體OXPHOS 發揮重要作用，OXPHOS 是抗腫瘤治療的新靶點。五倍子酸（3，4，5-三羥基苯甲酸，gallic acid，GA） 也稱為沒食子酸或棓酸，是一種天然多酚類化合物，已證實其對多種腫瘤細胞系具有抗腫瘤活性［5-8］。但GA 對肝癌細胞線粒體OXPHOS 的抑制作用尚未見報道。本研究以人肝癌HepG-2 細胞為模型，首次采用Seahorse Extracellular Analyzer 細胞能量代謝分析儀檢測GA 作用下HepG-2 細胞量代謝動態全過程，分析細胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）、線粒體細胞色素C（cytochrome C，CytC） 和細胞中ATP 水平的變化，從細胞能量代謝和與之密切相關的細胞器線粒體出發，探討GA 抗肝癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG-2 細胞（江蘇凱基生物技術股份有限公司），GA （美國Chromadex 公司），線粒體膜電位檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體分離試劑盒和胞漿蛋白抽提試劑盒（南京碧云天生物技術有限公司），CytC 單克隆抗體和β-actin 抗體（美國SAB 公司），化學發光檢測試劑盒（上海天能科技有限公司），胎牛血清和DMEM 培養基（美國Gibco 公司），線粒體壓力檢測試劑盒（美國Seahorse Bioscience 公司），ATP 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），全波長多功能酶標儀（美國Perkinelmer 公司），高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），電泳儀和半干轉印槽轉膜儀（美國Bio-Rad 公司），流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.2 MTT 法檢測HepG-2 細胞存活率參照文獻［9］方法，HepG-2 細胞以 每 孔100 μ L （1×105mL－1） 接種到96 孔細胞培養板，培養24 h 后分為對照組和不同濃度GA 組（加入終濃度0、3.125、 6.250、 12.500、 25.000、 50.000 和100.000 mg·L－1GA［10］），每個濃度設置4 個復孔，作用24、48 和72 h 后，每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h 后終止培養棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO 充分溶解紫色結晶物，酶標儀490 nm 下測定吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗組A 值－空白對照組A 值）/（對照組A 值－空白對照組A 值）×100%。

1.3 能量代謝分析儀檢測細胞線粒OXPHOS 水平對數生長期HepG-2 細胞接種于Seahorse XFp專用板（8 000 個/孔），培養24 h 后，分為對照組及6.25、 12.50 和25.00 mg·L－1GA 組，分別加入 含0、 6.25、 12.50 和25.00 mg·L－1GA 的DMEM 培養基作用24 h，更換能量分析專用培養液，按照線粒體壓力測定試劑盒說明書配制試劑，能量代謝分析儀實時檢測細胞線粒體耗氧率（oxygen consumption rate，OCR），代表細胞線粒體OXPHOS 活性，并根據OCR 值分析各組HepG-2 細胞的基礎有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸儲備能力和ATP 產生量。

1.4 流式細胞術檢測細胞MMP每孔1×106個HepG-2 細胞接種于6 孔細胞培養板，培養24 h 后分組同“1.3”，分別加入含（0、6.25、12.50 和25.0 mg·L－1）GA 的DMEM 培養基作用12 h，收集各組細胞按照Rhodamine123 染色試劑盒操作，激發波長505 nm，發射波長530 nm，流式細胞儀測定線粒體內Rhodamine123 的熒光強度，以強熒光細胞百分率表示MMP。

1.5 比色法檢測細胞中ATP 水平細胞分組及處理同“1.4”，離心收集各組細胞，加入提取液，冰浴超聲波破碎5 min，4 ℃、12 000 r·min－1離心3 min，取上清，置冰上檢測。嚴格按照ATP 水平測定試劑盒操作，分光光度計在波長636 nm 處測定各管A 值。ATP 水平（μmol·g－1prot）=（測定A 值－對照A 值） / （ 標 準 A 值 － 空 白A 值）×標準品濃度（1×103μmol·L－1）× 樣本測定前稀釋倍數/待測樣本蛋白濃度（g·L－1）。

1.6 Western blotting 法檢測細胞胞漿和線粒體中CytC 蛋白表達量細胞分組同“1.4”，收集GA處理48 h 的HepG-2 細胞，按照線粒體分離試劑盒操作制備線粒體裂解液，按照細胞胞漿蛋白抽提試劑盒操作制備胞質部分裂解液，BCA 法測定蛋白濃度。取20 μg 蛋白樣品上樣，經SDS-PAGE 電泳分離后，半干轉蛋白至硝酸纖維素膜（NC） 上，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，ECL 試劑進行化學發光。膠片于暗室曝光后，掃描并觀察結果。

1.7 吖啶橙染色觀察細胞形態表現細胞分組同“1.4”，收集GA 處理48 h 的HepG-2 細胞，制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×107mL－1，95 μL 細胞懸液加入5 μL 吖啶橙儲存液（0.1 g·L－1），染色15 min 后取1 滴細胞懸液點于潔凈玻片上，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察細胞形態表現。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡率每孔1×106個HepG-2 細胞接種于6 孔細胞培養板，24 h 后分為對照組及6.25、12.50 和25.00 mg·L－1組，更換含GA 0、 6.25、 12.50 和 25.00 mg·L－1GA 的DMEM 培養基作用48 h，離心收集細胞，按照Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。每個樣品加入5 μL Annexin V 溶液和5 μL PI 溶液避光孵育15 min，最后各加入400 μL PBS緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡。早期細胞凋亡率=早期凋亡細胞數/總細胞數×100%，晚期細胞凋亡率=晚期凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.9 統計學分析采用SPSS17.0 統計軟件進行統計學分析。各組HepG-2 細胞存活率、基礎有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸儲備能力、ATP 產生量、MMP 和ATP 水平以及細胞凋亡率均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組HepG-2 細胞存活率對照組HepG-2 細胞生長活躍，經不同濃度GA 處理24、48 和72 h后，各劑量GA 組HepG-2 細胞存活率均不同程度降低（P＜0.05 或P＜0.01），并呈明顯的時間和濃度依賴性。見圖1。

2.2 各組HepG-2 細胞線粒體OXPHOS與對照組比較，不同濃度GA 組HepG-2 細胞基礎有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸儲備能力和ATP 產生量均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2。

圖1 GA 作用不同時間各組HepG-2 細胞存活率Fig.1 Survival rates of HepG-2 cells in various groups after treated with GA for different time

圖2 各組HepG-2 細胞線粒體OXPHOSFig.2 Mitochondrial OXPHOS of HepG-2 cells in various groups

2.3 各組HepG-2 細胞MMP 和ATP 水平GA 作用24 h，HepG-2 細胞中強熒光細胞百分率逐漸減少。6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 組強熒光細胞 百 分 率 即MMP 分 別 為（73.12±4.61）%、（65.49±4.32）%和（38.64±5.93）%，與對照組［（94.38±2.18）%］ 比較均明顯降低（P＜0.05），見圖3。與對照組比較，不同濃度GA 組細胞 中ATP 水 平 均 明 顯 降 低（P＜0.05 或P＜0.01），6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 組 細胞中ATP 水平分別降低至61.11%、45.56% 和30.24%，見圖4。

圖3 各組HepG-2 細胞MMPFig.3 MMP of HepG-2 cells in various groups

圖4 各組HepG-2 細胞ATP 水平Fig. 4 Levels of ATP in HepG-2 cells in various groups

2.4 各組HepG-2 細胞胞漿和線粒體中Cyt C 表達量對照組HepG-2 細胞胞漿無Cyt C 特異條帶，不同濃度GA 組細胞胞漿均檢測到Cyt C 表達，隨著GA 濃度的增加胞漿中Cyt C 表達量明顯增加；各組細胞線粒體均有Cyt C 特異條帶出現，不同濃度GA 組線粒體中Cyt C 表達量隨著GA 劑量的增加呈降低趨勢。見圖5。

圖5 各組HepG-2 細胞胞漿和線粒體中Cyt C 蛋白表達電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expressions of Cyt C protein in cytoplasm and mitochondria of HepG-2 cells in various groups

2.5 各組HepG-2 細胞凋亡形態表現及凋亡率對照組HepG-2 細胞形態飽滿，細胞質呈均勻彌散綠色熒光，細胞核形態規則； GA 處理48 h 后不同濃度GA 組HepG-2 細胞體積縮小，細胞核碎裂，染色質凝集，呈凋亡細胞的形態學變化（圖6）。進一步采用Annexin V-FITC/PI 雙染定量檢測細胞 凋 亡 率，GA 作 用48 h 后，6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 組 早 期 細 胞 凋 亡 率 分 別 為（10.8±0.8）% 、（18.7±0.7）% 和 （26.9±0.8）%，與對照組［（0.2±0.1）%］比較明顯升高（P＜0.05）；晚期細胞凋亡率分別為（1.8±0.4）%、（11.2±0.6）%和（20.1±0.5）%，與對照組［（0.3±0.1）%］比較明顯升高（P＜0.05）。見圖7。

圖6 吖啶橙染色觀察各組HepG-2 細胞形態表現（×100）Fig.6 Morphology of HepG-2 cells in various groups observed by acridine orange staining（×100）

圖7 流式細胞術檢測各組HepG-2 細胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of HepG-2 cells in various groups detected by flow cytometry

3 討 論

全球50% 以上的新發和死亡肝癌患者在中國［11］。肝癌起病隱匿，外科手術是首選治療方法，但能獲得手術切除機會的患者僅占20%～30%［12］。肝癌患者術后5 年復發率高達50%～70%，存活率僅為20%～30%［13］。因此研發高效、低毒的抗肝癌藥物十分迫切［14-15］。本研究利用人肝癌HepG-2細胞，從細胞增殖、線粒體OXPHOS 抑制和細胞凋亡等方面觀察GA 對HepG-2 的抗腫瘤作用及潛在機制。

近年來，多個科研團隊［16-18］將OXPHOS 抑制劑用于腫瘤治療均取得了滿意的療效。ZHANG 等［16］研究發現：OXPHOS 抑制劑IACS-010759 在體內體外可明顯抑制伊布替尼耐藥的套細胞淋巴瘤細胞的生長。ZHAO 等［17］研究發現：維生素E 衍生物ESeroS GS 可通過下調己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）及具有電子傳遞功能的復合物Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ（complexⅡ/Ⅲ/Ⅳ） 等的表達，降低乳腺癌細胞MMP，同時抑制乳腺癌細胞糖酵解和OXPHOS，從而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲；范霞霞等［18］研究表明：天然二萜衍生物Jar-TTA 通過雙重抑制糖酵解和線粒體OXPHOS誘導食管癌細胞凋亡，其機制可能與Jar-TTA 降低食管癌細胞MMP 進而干擾線粒體OXPHOS 功能，以及下調葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLIT4） 和乳酸脫氫酶A（L-actate dehydrogenase A chain，LDHA）而抑制葡萄糖攝取和糖酵解進程有關。線粒體內膜（inner mitochondrial membrane，IMM） 是OXPHOS 產生ATP 的部位，線粒體基質中的三羧酸循環利用葡萄糖的代謝產物產生煙酰胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），并將其提供給位于線粒體內膜的電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC），線粒體ATP 合成酶利用ETC 產生的質子梯度作為驅動力催化ADP 磷酸化生成ATP［19-20］。本研究中首先采用MTT 法檢測GA 對HepG-2 細胞增殖的影響，結果顯示：在體外GA 可有效抑制HepG-2 細胞增殖；細胞能量代謝分析儀檢測GA可明顯抑制HepG-2 細胞線粒體OXPHOS 活性，與對照組比較，GA 處理組HepG-2 細胞基礎有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸儲備能力和ATP 產生量均明顯降低。

IMM 的完整和非滲透性保證了線粒體功能的正常［21］，MMP 反應了沿著電子傳遞鏈電子傳遞而形成的質子梯度，是線粒體功能完整性的指標，其完整性主要由ETC 和ATP 合酶維持［22］。本研究結果顯示：GA 能明顯降低HepG-2 細胞MMP，減少ATP 產生。HepG-2 細胞MMP 下降，導致線粒體通透性增加，存在于線粒體中的Cyt C 釋放入胞漿，Cyt C 啟動細胞凋亡線粒體信號轉導通路，最終激活半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）級聯反應誘導HepG-2細胞凋亡［23-25］。本研究中吖啶橙染色和流式細胞儀檢測結果顯示： 不同濃度GA 在體外可誘導HepG-2 細胞凋亡，不同濃度GA 作用HepG-2 細胞48 h 后，早期細胞凋亡率達到和晚期凋亡細胞率達到均明顯提高。

綜上所述，本研究將細胞能量代謝與抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡相關聯，闡明GA 可能通過降低HepG-2 細胞MMP，抑制線粒體OXPHOS 功能，誘導腫瘤細胞凋亡。GA 是否對線粒體中具有電子傳遞功能的complex Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ具有調控作用需進一步研究。