水蛭素聯合阿托伐他汀對急性心肌梗死大鼠血管內皮功能的影響

成 穎, 楊 靜, 饒 莉, 薛 強, 胡 杰, 付 樂, 張巧月

（1. 河北省唐山市工人醫院急診科，河北 唐山 063000；2. 河北省唐山市工人醫院風濕免疫科，河北唐山 063000；3. 河北省唐山市工人醫院藥學部，河北 唐山 063000）

在我國，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發病率和死亡率逐年升高，是臨床上較為常見的心血管急癥之一。研究［1］表明：血管內皮細胞功能紊亂參與AMI 的發展過程。凝血酶主要通過損傷內皮細胞和釋放炎性細胞因子促進血管栓塞斑塊形成［2-3］。研究［4］顯示：水蛭素是活性很強的特異性凝血酶抑制劑，能夠抑制凝血酶對內源性和外源性凝血系統的激活作用。他汀類藥物是公認為治療心肌梗死基礎藥物之一，目前國內外尚未發現關于水蛭素和阿托伐他汀聯合應用于急性心肌梗死的報道。本研究通過觀察水蛭素聯合阿托伐他汀對AMI 大鼠心肌梗死面積、心肌組織病理和內皮損傷相關指標的影響，評價水蛭素聯合阿托伐他汀對急性心肌梗死的保護作用，為AMI 的臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SD 大鼠50 只，雄性，體質量200～250 g，購于河北以嶺醫藥研究院有限公司，動物使用許可證號：SYXK （冀）2015-0064。實驗前大鼠適應性飼養1 周，實驗期間自由攝食和飲水。水蛭素購自南寧市金海科康生物醫藥科技有限公司，阿托伐他汀鈣片購自輝瑞制藥有限公司（國藥準字H20051408），2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC） 購自北京沃比森科技有限公司，鼠抗人血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1） 和細胞間黏 附分子1（intercellularcelladhesion molecule-1，ICAM-1）單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，內皮素-1（endothelin-1，ET-1）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫 瘤 壞 死 因 子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自武漢Boster有限公司。CX21 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司），DG-3022 型酶標儀（南京華東電子管廠）。

1.2 實驗動物模型的建立采用結扎左冠脈前降支的 方 法［5］建 立 大 鼠AMI 模 型。 給 予 大 鼠3 mL·kg－1的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，碘伏消毒，剪開頸部皮膚，分離皮下組織及肌肉，斷第4 肋骨，打開胸腔，剪開心包，露出心臟，在左心耳下緣約2 mm 處結扎冠狀動脈前降支，20 min 后左心室前壁顏色變蒼白、收縮力減弱即認為造模成功。假手術組只穿線不結扎。

1.3 實驗動物分組及給藥50 只SD 大鼠隨機分為假手術組、模型組、水蛭素組、阿托伐他汀組和聯合組。水蛭素組、阿托伐他汀組和聯合組大鼠分別灌胃給予水蛭素50 U·kg－1、阿托伐他汀10 mg·kg－1［6］及水蛭素50 U·kg－1+阿托伐他汀10 mg·kg－1，假手術組和模型組大鼠給予等量生理鹽水，連續給藥4 周。

1.4 TTC 染色法檢測大鼠心肌梗死面積取5 只大鼠處死后，迅速取下心臟，主動脈逆向插管，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗心臟，經主動脈注入TTC，37 ℃孵育30 min，壞死心肌呈現白色，非壞死心肌呈紅色，置于－80 ℃冰箱保存10 min，切片（厚度為1.0 mm），采用10%甲醛溶液固定過夜。采用Image J 軟件計算左室心肌壞死面積和左室總面積，心肌梗死面積百分比=左室心肌壞死面積/左室總面積×100%。

1.5 HE 染色觀察大鼠心肌組織病理形態表現取5 只大鼠處死后，迅速取下心臟，取心肌梗死區，切片，置于4 %多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），行蘇木精-伊紅染色，封片后置于顯微鏡下觀察。

1.6 Western blotting 法檢測大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平取大鼠心肌梗死區，加入裂解液，勻漿，12 000 r·min－1離心15 min 后取上清液，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取50 μg 蛋白上樣，進行凝膠電泳，將蛋白轉到PVDF 膜上，封閉液孵育1 h，分別加入ICAM-1、VCAM-1 和GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP 標記的二抗，37 ℃孵育1 h，發光底物孵育3 min，顯影，采用Image J 軟件分析，目的蛋白表達水平以目的蛋白條帶吸光度（A）值與GAPDH蛋白條帶A 值比值表示。

1.7 ELISA 法檢測大鼠血清中ET-1、vWF、NO、TNF-α 和IL-6 水平大鼠處死前眼眶取血，于離心機1 500 r·min－1離心10 min，按照ELISA 試劑盒說明書檢測，將標準品稀釋5 個梯度，各個梯度均設置空白孔和樣品孔，在反應孔內分別加入標準品、待測樣品、抗體，孵育1 h，加入顯色劑，取出酶標板加入硫酸終止液后，用酶標儀測定結果并記錄A 值，根據標準曲線計算所檢測樣品濃度。

1.8 統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠心肌梗死面積，心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平，血清中ET-1、vWF 、NO、TNF-α 和IL-6 水平，經正態性檢驗均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積假手術組大鼠未發生心肌梗死。與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯合組大鼠心肌梗死面積均明顯減小（P＜0.05）；與水蛭素組和阿托伐他汀組比較，聯合組大鼠心肌梗死面積均明顯減小（P＜0.05）。見表1和圖1。

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態表現假手術組大鼠心肌細胞排列緊密，無明顯炎癥細胞浸潤；與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，部分細胞不完整，心肌壞死程度嚴重，有炎性細胞浸潤；與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯合組大鼠心肌細胞排列較整齊，心肌壞死程度明顯改善，炎性細胞浸潤情況明顯減輕。見圖2。

表1 各組大鼠心肌梗死面積百分比Tab. 1 Percentages of myocardial infarction areas of rats in various groups

表1 各組大鼠心肌梗死面積百分比Tab. 1 Percentages of myocardial infarction areas of rats in various groups

*P＜0.05 compared with model group；△P＜0.05 compared with hirudin group；#P＜0.05 compared with atorvastatin group.

Group Sham operation Model Hirudin Atorvastatin Combination Percentage of myocardial infarction area 0 54.20±2.61 42.31±2.14*36.22±1.89*△23.96±1.76*△#

圖1 各組大鼠心肌組織TTC 染色結果Fig.1 Results of TTC staining of myocardium tissue of rats in various groups

2.3 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯合組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與水蛭素組和阿托伐他汀組比較，聯合組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，水蛭素組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠血清中內皮損傷指標水平與假手術組比較，模型組大鼠血清中ET-1 和vWF 水平明顯升高（P＜0.05），NO 水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯合組大鼠血清中ET-1 和vWF 水平明顯降低（P＜0.05），NO 水平明顯升高（P＜0.05）；與水蛭素組和阿伐他汀組比較，聯合組大鼠血清ET-1 和vWF 水平明顯降低（P＜0.05），NO 水平明顯升高（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，水蛭素組大鼠血清中NO 水平明顯升高（P＜0.05）。見表3。

2.5 各組大鼠血清中炎性細胞因子水平與假手術組比較，模型組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯合組大鼠血清中TNF-α 和IL-6水平明顯降低（P＜0.05）；與水蛭素組和阿托伐他汀組比較，聯合組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀組比較，水蛭素組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

3 討 論

血管內皮細胞具有自分泌、旁分泌和內分泌功能，能調節血液流動、血管緊張性、平滑肌細胞增殖和管壁炎癥修復等，血管內皮功能損傷是AMI的主要發病因素之一［7-8］。血管內皮功能障礙通過分泌ET-1、vWF 和NO 等血管活性物質，影響成纖維細胞增殖，促進心肌梗死的病情發展［9］。ET-1 是內皮細胞釋放并具有收縮血管的活性物質，可引起冠狀動脈收縮痙攣，使血管阻力增加，進一步加重內皮功能的損傷［10］。vWF 是內皮細胞和巨核細胞分泌的一種多聚體糖蛋白，是反映內皮細胞損傷的敏感指標，血清中vWF 具有促進血小板黏附和聚集的作用，介導血小板釋放功能和纖溶過程，促進血栓形成，是缺血性心臟病的獨立危險因子［11］。NO 是內皮細胞產生的強大舒血管物質，能保 護 血 管 內 皮［12］。血 清 中ET-1、vWF 和NO 水 平可作為血管內皮功能指標［13］。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清中ET-1 和vWF水平明顯升高，NO 水平明顯降低；給予水蛭素或阿托伐他汀干預后，大鼠血清ET-1 和vWF 水平明顯降低，NO 水平明顯升高，說明水蛭素和阿托伐他汀均對血管內皮功能起保護作用，而且二者聯合使用療效明顯提高。

圖2 各組大鼠心肌組織病理形態表現（HE，×200）Fig.2 Pathomorphology of myocardium tissue of rats in various groups（HE，×200）

表2 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平Tab. 2 Expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平Tab. 2 Expression levels of VCAM-1 and ICAM-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

*P＜0.05 compared with sham operation group； △P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with hirudin group；○P＜0.05 compared with atorvastatin group.

Group Sham operation Model Hirudin Atorvastatin Combination VCAM-1 0.22±0.02 0.56±0.03*0.34±0.02△○0.43±0.03△#0.28±0.03△#○ICAM-1 0.26±0.02 0.82±0.04*0.38±0.03△○0.56±0.04△#0.25±0.02△#○

表3 各組大鼠血清中ET-1、vWF 和NO 水平Tab.3 Levels of ET-1, vWF and NO in serum of rats in various groups

表3 各組大鼠血清中ET-1、vWF 和NO 水平Tab.3 Levels of ET-1, vWF and NO in serum of rats in various groups

*P＜0.05 compared with sham operation group； △P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with hirudin group；○P＜0.05 compared with atorvastatin group.

Group Sham operation Model Hirudin Atorvastatin Combination ET-1 55.31±4.30 126.20±9.74*98.31±9.06△91.20±8.87△70.31±6.01△#○vWF 4.56±0.64 8.21±0.73*6.12±0.51△6.54±0.62△5.26±0.59△#○NO 61.26±5.34 23.51±1.99*39.42±2.56△○31.55±2.61△#54.80±5.03△#○

表4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in various groups

表4 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in serum of rats in various groups

*P＜0.05 compared with sham operation group； △P＜0.05 compared with model group； #P＜0.05 compared with hirudin group；○P＜0.05 compared with atorvastatin group.

Group Sham operation Model Hirudin Atorvastatin Combination TNF-α 87.20±10.26 198.26±15.31*123.40±11.20△○147.29±10.54△#104.82±9.33△#○IL-6 61.23±8.65 120.44±10.16*84.20±8.84△○102.31±11.23△#70.51±9.30△#○

ICAM-1 和VCAM-1 是黏附分子家族中免疫球蛋白超家族成員。ICAM-1 主要參與各細胞間的黏附作用，其高表達能促進血管生長［14］。VCAM-1能夠介導細胞間移動，并與異位內膜細胞存活、分裂和增殖有關聯［15-16］。本研究結果顯示：模型組大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高，其共同參與心肌梗死炎癥反應過程，同時可作為黏附分子ICAM-1 及VCAM-1 表 達 的 強 誘 導 劑。研 究［17-18］表明：IL-6 可調節C 反應蛋白的合成，從而增加ICAM-1 的表達，促進血小板的聚集，同時促進TNF-α 分泌。TNF-α 可增強白 細胞趨化作用，直接損傷內皮細胞［19］。本研究結果顯示：給予水蛭素或阿托伐他汀干預后，水蛭素組、阿托伐他汀組和聯合組大鼠心肌組織中VCAM-1 和ICAM-1 蛋白表達水平以及血清中TNF-α 和IL-6 水平均降低，說明水蛭素具有明顯抗炎作用，與文獻［20］報道一致，可通過抑制炎癥反應起到減少細胞黏附的作用，與阿托伐他汀聯合應用療效明顯提高。

綜上所述，水蛭素和阿托伐他汀能夠通過調節血管內皮活性物質分泌、抑制炎癥反應和減少細胞黏附，起到保護血管內皮功能的作用，水蛭素和阿托伐他汀聯合治療效果優于單用水蛭素或阿托伐他汀。