姜黃素對結直腸癌小鼠腫瘤生長的抑制作用及其PTEN/PI3K/Akt 信號通路機制

裴永彬, 王桂琦, 李 衛, 姜 霞, 姜海波, 趙增仁

（河北醫科大學第一醫院普外三科，河北 石家莊 050031）

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發病機制復雜，其發生發展涉及多系統多組織的動態變化過程，多種信號通路參與結直腸癌的發病過程。在眾多分子機制中，第10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白的同源基因 （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）/磷酯 酰 肌 醇-3 激 酶 （phosphatidylinositol kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路為非常重要的一環，該信號通路參與結直腸癌細胞增殖、分化、凋亡和轉移等多種病理過程，抑制該信號通路對抑制結直腸癌生長具有重要意義［1］。姜黃素為一種植物多酚，從植物姜黃根莖中提取，具有抗氧化、抗炎、抗動脈硬化、降血脂和抗腫瘤等多種藥理作用［2］。姜黃素的抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤增殖和促進腫瘤凋亡實現的［3］。姜黃素可通過多種信號通路發揮其抗腫瘤作用，李 秀 娟 等［4］研 究 發 現：姜 黃 素 可 通 過 抑 制PTEN/PI3K/Akt 信號通路進而抑制食管癌細胞的增殖并促進食管癌細胞凋亡。姜黃素對結直腸癌也具有抑制作用，盧曉云等［5］研究發現：姜黃素可通過抑制上皮間質轉化發揮抑制結腸炎相關結直腸癌的作用。但姜黃素對結直腸癌PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響尚不清楚。本研究通過接種結直腸癌細胞建立小鼠結直腸癌模型，觀察姜黃素對結直腸癌腫瘤生長及PTEN/PI3K/Akt 信號通路的影響，探討姜黃素抑制結直腸癌的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器SPF 級BABL/c 小鼠，體質量19～23 g、雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（京） 2012-0001。人結直腸癌LOVO 細胞（上海中科院）。姜黃素（純度≥95%，美國Sigma公司），RPMI-1640 培養液、胎牛血清和胰蛋白酶（上海安博廣利生物科技有限公司），Western blotting 相關試劑（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗鼠增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ，PCNA） 多克隆抗體、兔抗鼠人髓細胞增生原癌基因c-Myc 多克隆抗體、兔抗鼠天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3 （cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase 3） 多 克 隆 抗體、兔抗鼠PTEN 多克隆抗體、兔抗鼠Akt 多克隆抗體和兔抗鼠磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體（美國CST公司）。BX53顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實驗動物分組及模型制備60 只BABL/c 小鼠隨機分為模型組、低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組，每組15只。按照文獻［6］的方法建立小鼠結直腸癌模型，具體方法：取結直腸癌LOVO 細胞，在RPMI-1640 全培養基中培養和傳代，取對數期生長的結直腸癌細胞，調整細胞密度為2×106mL－1，將其接種至小鼠右前肢腋部皮下，每只小鼠接種0.2 mL。接種后7 d，檢測每只小鼠腋下腫瘤直徑，腫瘤直徑＞10 mm 表示造模成功。模型組、低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組各建模成功12、14、13 和13 只小鼠。各組小鼠建模成功后處理：低、中和高劑量姜黃 素 組 分 別 給 予25、50 和100 mg·kg－1姜 黃 素 灌胃［7］，共4 周；模型組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，共4 周。

1.3 各組小鼠腫瘤體積、腫瘤質量和抑瘤率的檢測各組小鼠末次灌胃24 h 后，脫頸處死，取出腋部皮下腫瘤組織，游標卡尺測量腫瘤組織長短徑，稱取腫瘤組織質量，計算腫瘤體積和抑瘤率。腫瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑2/2，抑瘤率=（模型組小鼠腫瘤體積—目標組小鼠腫瘤體積）/模型組小鼠腫瘤體積×100%。

1.4 免疫組織化學染色檢測各組小鼠腫瘤組織中PCNA 蛋白表達情況及細胞增殖指數（proliferationindex，PI）取各組小鼠腫瘤組織石蠟切片，常規脫蠟至水，加入H2O2孵育20 min 消除內源性過氧化物酶活性，PBS 緩沖液沖洗，檸檬酸修復抗原，山羊血清封閉10 min，加入一抗兔抗鼠PCNA 多克隆抗體（1∶300）過夜孵育，PBS 緩沖液沖洗，加入HRP 多聚體標記的山羊抗兔IgG 抗體孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗，DAB 顯色，反應呈棕黃色時終止染色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中心樹膠封片，顯微鏡下觀察染色情況。結果判定：顯微鏡下細胞核被染成棕褐色或棕黃色為陽性細胞，在400 倍視野下拍照，計算PI，PI=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.5 HE 染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理形態表現取小鼠腫瘤組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成后4 μm 厚切片，脫蠟至水，常規HE 染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理形態表現。

1.6 Western blotting 法檢測各組小鼠腫瘤組織中c-Myc、caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋 白 表 達 水平取各組小鼠腫瘤組織100 mg，加入RIPA 研磨碎，提取總蛋白，BCA 法測定腫瘤組織蛋白濃度，取50 μg 蛋白上樣，經電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗兔抗鼠c-Myc 多克隆抗體、兔抗鼠caspase3 多克隆抗體、兔抗鼠PTEN 多克隆抗體、兔抗鼠Akt 多克隆抗體和兔抗鼠p-Akt 多克隆抗體，稀釋比例為1∶1 000，過夜孵育，加入二抗（1∶5 000） 孵 育1 h，加 入ECL 顯 影，采 用Vilber FusionCapt Advance 軟件測定蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參。目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.7 統計學分析采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。各組小鼠腫瘤體積，腫瘤質量，抑瘤率，腫 瘤 組 織PI，腫 瘤 組 織 中c-Myc、 caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表達水平，經正態性檢驗均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠腫瘤體積、腫瘤質量和抑瘤率各組小鼠腫瘤體積、腫瘤質量和抑瘤率比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤體積和腫瘤質量均明顯降低（P＜0.05）；與低劑量姜黃素組比較，中和高劑量姜黃素組小鼠腫瘤體積和腫瘤質量均明顯降低（P＜0.05），抑瘤率明顯升高（P＜0.05）；與中劑量姜黃素組比較，高劑量姜黃素組小鼠腫瘤體積和腫瘤質量均明顯降低（P＜0.05），抑瘤率明顯升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤體積、腫瘤質量和抑瘤率Fig.1 Tumor volumes, tumor weights and inhibitory rates of tumor of mice in various groups

2.2 各組小鼠腫瘤組織中PCNA 蛋白表達情況及PI 免疫組織化學染色結果顯示：模型組小鼠腫瘤組織中可見大量PCNA 陽性細胞；與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中PCNA 陽性細胞數量明顯減少，且呈劑量依賴性。見圖2。與模型組（78.56±12.31） 比較，低、中和高劑量姜黃素 組 小 鼠 腫 瘤 組 織PI （62.14±10.36、36.26±9.17 和19.75±5.21）明顯降低（P＜0.05）；不同劑量姜黃素組間小鼠腫瘤組織PI 比較差異有統計學意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖2 免疫組織化學染色檢測各組小鼠腫瘤組織中PCNA 蛋白表達情況（×200）Fig. 2 Expressions of PCNA protein in tumor tissue of mice in various groups detected by immunohistochemistry staining(×200)

2.3 各組小鼠腫瘤組織病理形態表現模型組小鼠腫瘤組織中細胞排列紊亂，核質比例增加，核染色深；與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中細胞排列相對整齊，核質比例下降，核染色淺，且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組小鼠腫瘤組織病理形態表現（HE,×200）Fig.3 Pathomorphology of tumor tissue of mice in various groups（HE,×200）

2.4 各組小鼠腫瘤組織中c-Myc、caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表達水平各組小鼠腫瘤組織中Akt 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。 與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中c-Myc 和p-Akt 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量姜黃素組比較，中和高劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中c-Myc 和p-Akt 蛋白 表 達 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與中劑量姜黃素組比較，高劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中c-Myc 和p-Akt 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見圖4 和圖5。

3 討 論

姜黃素是姜黃發揮作用的主要活性成分，具有通經止痛和破血行氣等功效，對多種疾病具有治療作用［8］。本研究結果顯示：姜黃素可降低結直腸癌小鼠腫瘤質量和腫瘤體積，抑制結直腸癌腫瘤組織生長。近年來，姜黃素在抗腫瘤方面的作用日益受到重視，在多種惡性腫瘤中，具有誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生長和抑制腫瘤細胞增殖等作用［9-10］。姜黃素對結直腸癌細胞也有抑制作用，如姜黃素可通過靶向PBK 抑制結直腸癌HCT116 細胞增殖［11］；姜黃素可抑制人結直腸癌細胞上皮間充質轉化和遷移［12］。本研究結果與既往研究結果一致，表明姜黃素對結直腸癌的生長具有抑制作用。

本研究結果顯示：與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織細胞排列相對整齊，核質比例下降，核染色淺；腫瘤組織中PCNA 陽性細胞明顯降低，呈劑量依賴性；腫瘤組織PI 值降低，c-Myc蛋白表達水平降低，caspase3 蛋白表達水平升高。PCNA 是一種公認的細胞增殖標志物，根據PCNA計算得到的PI 可反應組織細胞的增殖能力［13］。c-Myc 既是一種易位基因，又是一種調節基因，可促進細胞分裂，使細胞無限增殖獲得永生化功能，與多種腫瘤的發生發展有關；在惡性腫瘤中c-Myc蛋白表達水平升高，在一定程度上反映細胞增殖能力增強［14］。本研究結果顯示：各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中PCNA 和c-Myc 蛋白表達水平降低及PI 值降低，表明姜黃素具有抑制結直腸癌細胞增殖的作用。caspase 家族是細胞凋亡的關鍵元件，caspase3 的高表達均可導致細胞凋亡；caspase3 處于細胞凋亡級聯反應的下游，是重要的效應型caspase，是細胞凋亡的關鍵執行者，其活化標志細胞進入不可逆凋亡階段［15］。本研究中各劑量姜黃素組腫瘤組織中caspase3 蛋白表達水平升高，表明姜黃素可促進結直腸癌腫瘤細胞凋亡，提示姜黃素可通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡發揮對結直腸癌生長的抑制作用。

圖4 Western blotting 法檢測各組小鼠腫瘤組織中c-Myc 和caspase3 蛋白表達電泳圖(A)和直條圖（B）Fig. 4 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of c-Myc and caspase3 proteins in tumor tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

腫瘤細胞的增殖和凋亡受多種信號通路調控，PTEN/PI3K/Akt 信號通路在腫瘤生長中也發揮重要的調控作用［16］。本研究結果顯示：與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中PTEN 蛋白表達水平升高，p-Akt 蛋白表達水平降低。PTEN 為抑癌基因，PTEN 表達上調可能是由于PI3K 的活化產物PIP3 去磷酸化，導致細胞內PIP3 水平降低，進而抑制Akt 激活，導致活化的p-Akt 水平降低［17-18］。c-Myc 為PTEN/PI3K/Akt 信 號 通 路 的 下游靶基因，PTEN/PI3K/Akt 信號通路的激活可促進c-Myc 表 達，從 而 促 進 腫 瘤 細 胞 增 殖［19］。caspase3 也 受PTEN/PI3K/Akt 調 控，PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活可抑制下游caspase3 蛋白的表達，從而抑制細胞凋亡［20］。在惡性腫瘤發生發展過程中，PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活，PTEN 水平降低，p-Akt 水平升高，抑制PTEN/PI3K/Akt 信號通路活化可抑制惡性腫瘤的發生發展。研究［21-22］顯示：姜黃素可通過PTEN/PI3K/Akt 信號通路發揮抗腫瘤作用，姜黃素可通過PTEN/PI3K/Akt 信號通路抑制胃癌的生物學活性。本研究中，模型組小鼠腫瘤組織中PTEN 蛋白表達水平降低，p-Akt 蛋白表達水平升高，表明結直腸癌腫瘤組織中PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活；姜黃素處理后結直腸癌組織中PTEN 蛋白水平升高，p-Akt 蛋白水平降低，表明姜黃素可抑制PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活。結合本研究中姜黃素對c-Myc 和caspase3 的影響，提示姜黃素可能通過抑制PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活，導致下游c-Myc 蛋白水平降低、caspase3 蛋白水平升高，進而抑制結直腸癌腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，發揮對結直腸癌生長的抑制作用。

圖5 Western blotting 法檢測各組小鼠腫瘤組織中PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表達電泳圖(A)和直條圖（B）Fig. 5 Electrophoregram (A) and histogram(B) of PTEN, Akt and p-Akt proteins in tumor tissue of mice in various groups

綜上所述，姜黃素對結直腸癌的生長具有抑制作用，其機制可能是姜黃素通過抑制PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活抑制結直腸癌細胞增殖并促進結直腸癌細胞凋亡。