丁酸鈉聯合X 射線照射對肺癌A549 細胞增殖的抑制作用及其對細胞周期的影響

李官虎, 郎慶旭, 劉純巖, 劉 沁, 耿夢柔, 李曉倩, 王珍琦

（1. 吉林大學公共衛生學院 國家衛健委放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021；2. 吉林大學第二醫院放射線科，吉林 長春130041）

近年來，我國肺癌發病率逐年升高。肺癌在所有癌癥中死亡率排第1 位［1］，平均5 年存活率約為18%，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 占85%，多數患者確診時難以手術切除，其治療主要依靠化療與放療相結合。近十幾年來，盡管放療技術和全身治療取得很大進展，但在NSCLC 治療方面仍然收效甚微。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）可以抑制組蛋白的乙酰化，使染色質結構松散，從而改變基因表達，抑制細胞生長，通過誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡來改變細胞應答［2-5］。因此，近年來HDACi 作為一種新的抗癌藥物受到重視，超過28 種HDACi 正在研究過程中［6］。研 究［7］表 明：第2 代HDACi Quisinostat（JNJ-26481585）治療NSCLC 取得較好的效果，提示 組 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 （histone deacetyl transferases，HADC） 和HDACi 可 為NSCLC 提供新的治療策略。然而，癌細胞對HDACi 的抗性常常限制了其應用［8-9］。為了提高HDACi 治療癌癥的療效，目前已研究出多種治療方法的組合。在體內外實驗中，已經證明HDACi 與其他抗癌藥物可以在NSCLC 中產生協同或加成效應［10-14］。有研究［15-16］報 道： HDACi 可 以 抑 制 同 源 重 組（homologous recombination，HR） 相關基因表達，為其輻射增敏作用提供了理論依據，但其具體機制尚需進一步探討。

丁酸鈉（sodium butyrate，NaBt）是第一個被發現的HDAC 非特異性抑制劑，是常用的Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類HDACi［17］，與其他抑制劑比較，其對HDAC的抑制效果更明顯，可抑制結腸癌、前列腺癌、乳腺癌和白血病等多種腫瘤細胞的生長，誘導其分化，使腫瘤細胞表現出類似正常細胞的行為，同時誘導細胞凋亡，抑制腫瘤的侵襲和浸潤，影響細胞周期調控等［18］，但其是否具有放射增敏作用及其分子機制尚未闡明。本研究通過檢測NaBt 單獨或聯合X 射線照射對肺癌A549 細胞的增殖抑制作用及對細胞周期的影響，探討NaBt 是否具有放射增敏作用，為NSCLC 的治療提供新的策略和理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人NSCLC A549 細胞購自中國科學院上海細胞庫，采用常規培養。培養條件：含10%胎牛血清的高糖DMEM，37℃、5%CO2和100%飽和濕度，細胞每3～4 d（即細胞密度在鋪滿皿底70%～80%時）傳代1 次。NaBt（美國Sigma 公司），胎牛血清（浙江杭州四季青生物制品分公司），高糖DMEM（美國Gibco 公司），胰蛋白酶（上海生物技術有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，美 國Solarbi 公 司），二 甲 基 亞 砜（DMSO，重慶東方試劑廠），CCK-8 試劑盒（美國Bimake 公司）。TDZ5 臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司），Pico&Fresco 臺式離心機（德國Heraeus 公司），X 射線深部輻照儀（型號X-RAD 320 ix，德國PXI 公司），高壓鍋（日本Yamato 公司），GAX-9240 干燥箱（上海博訊公司），細胞培養箱（新加坡ESCO 科技有限公司），Epoch 酶標儀（美國BioTek 公司），FACSCalibur流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.2 CCK-8 法檢測細胞增殖率將細胞接種于96 孔細胞培養板，每孔3×103個細胞，8 個復孔。細胞分為對照組、不同濃度（5、10、15、20 和25 mmol·L－1）NaBt 組、4 Gy X 射線照射組和不同濃度（5、10、15、20 和25 mmol·L－1）NaBt 聯合4 Gy X 射線照射組，同時設空白組。使用X 射線深部輻照儀照射，照射條件：電壓180 kV，電流20 mA，單次源靶距70 cm，劑量率1.0 Gy·min－1，照射時間4 min，照射劑量4 Gy。繼續培養細胞24、48 和72 h 后，采用CCK-8 法測定細胞活力，將每孔中的培養液吸出，加入100 μL 新鮮培養液，再向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續孵育3 h，用酶標儀在波長450 nm 處檢測吸光度（A）值。按照以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率= （加藥組A 值－空白組A 值）/（對照組A 值－空白組A 值）×100%。

1.3 流式細胞術檢測不同細胞周期細胞百分率將處于對數生長期的細胞接種于6 孔細胞培養板中，分 為 對 照 組、 10 mmol·L－1NaBt 組、20 mmol·L－1NaBt 組、4 Gy X 射 線 照 射 組、10 mmol·L－1NaBt 聯 合4 Gy X 射 線 照 射 組 和20 mmol·L－1NaBt 聯合4 Gy X 射線照射組（加入10 和20 mmol·L－1NaBt 24 h 后給予4 Gy X 射線照射）。培養24 h 后收集細胞，用0.25%胰酶消化成單細胞懸液后，1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，加入1 mL 預冷的PBS 緩沖液洗滌2 次，加10 mg·L－1RNA 酶50 μL 和5 mg·L－1碘 化 丙 啶（PI） 150 μL，4 ℃避光孵育30 min，用尼龍布過濾，流式細胞術檢測不同細胞周期細胞百分率。采用CellQuest 軟件收取細胞（每份樣品收取1.0×104個細胞），采用ModFit 軟件分析細胞周期，結果以細胞周期各時相細胞的百分率表示。

1.4 統計學分析采用SPSS 24.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖率和不同細胞周期細胞百分率均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞增殖率不同濃度NaBt 單獨作用A549 細胞24 h 后，細胞增殖率無明顯變化；作用48 和72 h 后，與 對 照 組 比 較，5、15、20 和25 mmol·L－1NaBt 組細胞增殖率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），并呈濃度和時間依賴性。

不同濃度NaBt 聯合4 Gy X 射線照射作用A549細胞24 h 后，細胞增殖率略有所升高。聯合作 用 48 h 后，與 對 照 組 比 較，15 、 20 和25 mmol·L－1NaBt 聯合4 Gy X 射線照射組細胞增殖率明顯降低（P＜0.01）；與4 Gy X 射線照射組比較，15、20 和25 mmol·L－1NaBt 聯合4 Gy X 射線照射組細胞增殖率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）；分 別 與15、20 和25 mmol·L－1NaBt 組 比較，15、20 和25 mmol·L－1NaBt 聯合4 Gy X 射線照射組細胞增殖率均明顯降低（P＜0.05）。聯合作用72 h 后，與對照組比較，不同濃度NaBt 聯合4 Gy X 射線照射組細胞增殖率明顯降低（P＜0.01）；與4 Gy X 射線照射組比較，不同濃度NaBt聯合4 Gy X 射線照射組細胞增殖率均明顯降低（P＜0.01）；與相對應濃度NaBt 組比較，20 和25 mmol·L－1NaBt 聯合4 Gy X 射線照射組細胞增殖率均明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 不同濃度NaBt 單獨或聯合4 Gy X 射線照射24、48 和72 h 后各組A549 細胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of A549 cells in various groups 24, 48 and 72 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-irradiation

表1 不同濃度NaBt 單獨或聯合4 Gy X 射線照射24、48 和72 h 后各組A549 細胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of A549 cells in various groups 24, 48 and 72 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-irradiation

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs NaBt group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 4 Gy X-ray irradiation group.

Group Proliferation rate（t/h）24 1.00±0.00 48 1.00±0.00 Control NaBt(mmol·L－1)5 10 15 20 25 4 Gy X-ray irradiation NaBt+4 Gy X-ray irradiation 5 mmol·L－1+4 Gy 10 mmol·L－1+4 Gy 15 mmol·L－1+4 Gy 20 mmol·L－1+4 Gy 25 mmol·L－1+4 Gy 0.95±0.33 0.98±0.32 0.98±0.28 1.00±0.03 0.96±0.04 1.02±0.01 72 1.00±0.00 0.95±0.01**0.98±0.01 0.96±0.01*0.95±0.01**0.91±0.02**0.98±0.01 0.61±0.01**0.51±0.04**0.58±0.02**0.62±0.01**0.53±0.03**0.96±0.05 0.61±0.03**##0.53±0.04**##0.55±0.03**##0.49±0.01**△△##0.39±0.02**△△##1.06±0.02*1.15±0.06*1.08±0.01**1.06±0.02**1.02±0.01 0.99±0.03 0.99±0.04 0.91±0.02**△##0.91±0.02**△#0.89±0.01**△##

2.2 各組不同細胞周期A549 細胞百分率NaBt單獨或聯合4 Gy X 射線照射作用24 h 后，與對照組比較，10 mmol·L－1NaBt 組G0/G1期細胞百分率明顯升高（P＜0.01），S 期細胞百分率明顯降低（P＜0.01）；20 mmol·L－1NaBt 組G0/G1期和G2+M 期細胞百分率均明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），S 期細胞 百 分 率 明 顯 降 低（P＜0.01）；4 Gy X 射線照射組和10 mmol·L－1NaBt 聯合4 Gy X 射線照射組G2+ M 期細胞百分率均明顯升高（P＜0.01），G0/G1期和S 期細胞百分率均明顯降低（P＜0.01）。見表2。

3 討 論

隨著醫療技術的不斷創新發展，疾病的診斷與治療手段日益提高，但是肺癌的發病率仍居高不下，5 年生存率維持在15%左右［19］。目前放射治療是治療肺癌的主要方法之一，NSCLC 的放射性治療推薦劑量非常高，往往達到60～70 Gy，高劑量的放射治療對癌細胞非常有效，也能夠在一定程度上控制患者的病情［20］。但由于癌細胞的輻射抗性，治療效果與預期相比仍有很大差距；同時，正常組織細胞對射線敏感，容易產生放射性肺纖維化和放射性炎癥，嚴重影響了患者的生存質量。增加腫瘤細胞對放療的敏感性無疑是提高療效的重要手段［21］。在影響腫瘤發生發展的諸多因素中，表觀遺傳學的改變是新的研究熱點。組蛋白修飾可以改變染色質的松散程度，也就增加了DNA 的暴露程度，表明組蛋白修飾成為放射增敏靶點的可能。

表2 不同濃度NaBt 單獨或聯合4 Gy X 射線照射作用24 h 后各組不同細胞周期A549 細胞百分率Tab.2 Percentages of A549 cells in different cell cycles in various groups 24 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-ray irradiation

表2 不同濃度NaBt 單獨或聯合4 Gy X 射線照射作用24 h 后各組不同細胞周期A549 細胞百分率Tab.2 Percentages of A549 cells in different cell cycles in various groups 24 h after treated with different concentrations of NaBt alone or combined with 4 Gy X-ray irradiation

“－”：No data.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

Group Percentage of A549 cells G0/G1 83.057 ± 0.071 G2 + M 2.060 ± 0.839 S Control NaBt(mmol·L－1)10 20 4 Gy X-ray irradiation 10 mmol·L－1 NaBt+4 Gy X-ray irradiation 20 mmol·L－1 NaBt+4 Gy X-ray irradiation 14.883±0.783 2.873±0.062**3.823±0.049**3.403±0.057**3.270±0.162**—93.203±0.482**88.890±0.538**69.103±0.501**64.133±0.904**—3.923±0.245 7.287±0.345*27.490±0.540**32.593±0.952**—

NaBt 是 第Ⅰ類HDACi。研 究［22］表 明：NaBt在體內外實驗中具有抑制腫瘤生長和誘導腫瘤細胞凋亡及分化的作用，且對機體有較低的細胞毒性。但其在肺癌中作用的研究尚未見報道。本研究結果顯示：NaBt 可以抑制肺癌A549 細胞增殖，呈時間和濃度依賴性，NaBt 和電離輻射聯合作用可增加A549 細胞的輻射敏感性，并且對細胞的增殖抑制更加明顯，表明對細胞毒性作用加強；NaBt 誘導A549 細胞發生G0/G1期阻滯，使細胞停滯在DNA合成前期，從而抑制腫瘤細胞的增殖；而單純電離輻射和NaBt 聯合電離輻射則誘導A549 細胞發生G2+M 期阻滯，使細胞停滯在對輻射更為敏感的G2+M 期，表明NaBt 對A549 細胞具有增殖抑制作用，并呈濃度依賴性；NaBt 與電離輻射的聯合作用效果明顯優于NaBt 單獨作用，對A549 細胞的抑制作用更強，而細胞周期的變化很可能是引起上述現象的因素之一，可能是NaBt 通過表觀遺傳的改變導致染色質結構的變化，進而引起的一系列變化，其詳細機制尚需從細胞凋亡、細胞自噬、細胞周期和DNA 損傷修復等方面進行深入的研究。同時，在其他對HDACi 的研究中也得到了類似的結果［23］。RIVERA 等［24］研究顯示： HDACi 阿貝司他（abexinostat） 與射線聯合應用對NSCLC 的體內外抗腫瘤作用增強。

另外，在本實驗中，采用NaBt 作用24 h 后再給予4 Gy X 射線照射，而本課題組在前期實驗中給藥后立即給予X 射線照射，并未出現聯合作用毒性作用的加強（結果未列出），表明表觀遺傳的改變需要一定的時間。

綜上所述，在體外實驗中，NaBt 對A549 細胞具有增殖抑制作用和放射增敏作用，并呈濃度和時間依賴性，NaBt 和X 射線的聯合抑制效果明顯優于二者單獨應用，其機制可能是二者聯合作用引起A549 細胞G2+M 期阻滯。NaBt 聯合X 射線照射可提高NSCLC 患者治療的有效性，為NSCLC 的治療提供了新的方法。