6個不同地理湖泊中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)肌肉組織氨基酸組成、營養評分及其差異性分析

田 燦，王美垚，李建林，宋長友，葛家春， 蘇勝彥,，唐永凱,

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業農村 部淡水漁業與種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081；3.江蘇省淡水水產研究所，南京 210017)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)屬節肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacca)十足目(Decapoda)，俗稱河蟹，廣泛分布于長江中下游地區，是我國重要的經濟型蟹類之一[1]，其營養豐富，肉質鮮美，受到廣大消費者的追捧。

氨基酸是合成生物體內蛋白質的原料來源，是重要的營養物質，各氨基酸含量的高低一定程度上決定著其營養價值的優劣[2-3]。生長環境、飼料及養殖方式等不同，其氨基酸含量也會出現一定差異[4-6]。必需氨基酸的組成和比例決定著食物蛋白質的營養價值，其組成越接近人體必需氨基酸，蛋白質營養價值越高[7-8]。基于氨基酸營養評分比較可食部位間的營養差異在白烏魚(OpniocepnalusargusvarKimnra)[9]、河鲀(Tetraodontidae)[10]、金槍魚[11]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[12]、中華絨螯蟹[13-16]等水產動物研究中應用廣泛。對中華絨螯蟹氨基酸營養品質的研究主要通過對其不同可食部位的營養價值比較分析[13-15]或者將可食部位混合后對其進行分析[16-18]。主成分分析、聚類分析、判別分析作為優良的多元統計方法在中華絨螯蟹群體間形態[19-20]、品質[21-22]、遺傳多樣性[23-24]等差異性研究中應用廣泛。本研究通過測量江蘇省內不同湖泊中華絨螯蟹肌肉組織中的氨基酸含量，采用多元統計方法分析比較中華絨螯蟹群體間氨基酸含量差異性，探究群體間的親緣關系，以期對中華絨螯蟹群體鑒別提供有效的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年8月16-20日采集了太湖(T)、陽澄湖(Y)、高郵湖(GY)、固城湖(G)、洪澤湖(H)、長蕩湖(C)的野生中華絨螯蟹群體，每個群體采集8個個體(雌雄各半)，活體解剖，軀體經冷凍處理后，精刮取出肌肉組織，避免其他組織污染，并保存于-40 ℃的冰箱中待氨基酸分析。

1.2 氨基酸分析

采用6 mol/L HCl水解法[25]對蛋白樣品進行酸水解，并使用Agilent-1100液相色譜儀對其進行氨基酸分析，其中色譜柱為ODS HYPERSIL(250 mm×4.60 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；流動相A：稱取6.50 g結晶乙酸鈉，加1 000 mL水溶解，200 μL三乙胺，5%醋酸調節pH至7.20±0.05，5 mL四氫呋喃，混合后備用。流動相B：稱取6.50 g結晶乙酸鈉，加200 mL水溶解，5%醋酸調節pH至7.20±0.05，400 mL乙腈、400 mL甲醇，混合后備用；流速：1.00 mL/min；紫外檢測波長：338 nm，262 nm (Pro,Hypro)；樣品衍生化：分別取樣品溶液1 μL、硼酸緩沖液5 μL混合3次后吸取OPA溶液1 μL，混合15 次，吸取FMOC-Cl溶液1 μL，混合15次，吸取水32 μL，混合5次后直接進樣測定；梯度洗脫程序見表1，采用外標法定量。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution mode

1.3 數據處理

采用SPSS23.0軟件對6湖泊中華絨螯蟹群體的氨基酸含量進行分析，結果均以平均值±標準誤(X±SE)表示。使用Levene’s法進行方差齊性檢驗，若實驗數據不滿足齊性方差檢驗，則對百分比數據進行平方根或者反正弦處理。使用ANOVA對實驗數據進行方差分析。氨基酸群體間差異進行單因子方差分析(以每種氨基酸為變量)，顯著性水平設為0.05，應用鄧肯氏法進行多重比較。

運用主成分分析、聚類分析，逐步判別分析方法對中華絨螯蟹肌肉組織氨基酸含量進行分析，判別準確率的計算參照李思發等[26]的方法。數據處理采用Excel和SPSS 23.0軟件。

1.4 氨基酸營養價值評價

根據聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織(FAO/WHO)建議的氨基酸評分標準和雞蛋蛋白的氨基酸模式進行比較[27-28]，按下列公式計算氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)和必需氨基酸指數(EAAI)。

式中：n為比較的必需氨基酸數目(n=7)；a～i為試驗蛋白質的必需氨基酸含量；ae～ie為雞蛋蛋白質的氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 中華絨螯蟹氨基酸含量間差異

從中華絨螯蟹雌雄群體肌肉中均分離出了17種氨基酸(色氨酸在鹽酸水解過程中與含醛基化合物反應生成黑色物質，從而被破壞)，見表2、3。包括9種必需氨基酸(EAA)：蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)；8種非必需氨基酸(NEAA)：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)。從單個氨基酸含量來看，各群體間Glu，Lys含量均較高，Cys含量最低。

雌蟹中(表2)，H群體總氨基酸(TAA)、EAA、NEAA含量均最高，其中TAA、EAA含量均顯著高于C、T、Y群體，與G、GY群體差異不顯著。NEAA含量顯著高于C、Y群體，與G、GY、T群體差異不顯著。雄蟹中(表3)，GY群體TAA、EAA、NEAA含量均最高，且顯著高于Y、H、T群體，與C、G群體差異不顯著。

由表2可知，雌蟹群體肌肉中EAA/TAA、EAA/NEAA均為C，G群體顯著高于GY、H、Y群體，T群體顯著低于其他群體，C、G群體無顯著性差異，GY、H、Y群體無顯著性差異；雄蟹群體中(表3)EAA/TAA、EAA/NEAA 均為C顯著高于H群體，G、GY、T、Y群體間差異不顯著。

表2 6個產地中華絨螯蟹雌性群體肌肉中主要氨基酸組成Tab.2 The amino acids contents in muscle of the female E.sinensis from six populations %

表3 6個產地中華絨螯蟹雄性群體肌肉中主要氨基酸組成Tab.3 The amino acids contents in muscle of the male E.sinensis from six populations %

% 續表3

2.2 基于氨基酸含量的主成分分析、聚類分析

基于6個湖泊中華絨螯蟹群體各氨基酸含量進行主成分分析、聚類分析。雌雄群體前2個主成分累計貢獻率均超過70%(表4)，包含了總變異的絕大部分，表明可以利用這兩個相互獨立的因子來概括各群體間氨基酸含量差異。提取第1主成分中貢獻率前十的因子作為散布圖數據，圖1為中華絨螯蟹雌雄群體第1、2主成分散布圖及聚類分析圖。

雌雄群體氨基酸主成分分析和聚類分析結果與其多重比較結果相似。雌蟹中，H、C、Y群體與其余群體重疊程度均較低，差異較明顯，GY、T群體重疊程度較高不易區分，且與G群體有一定重疊(圖1.a)。其聚類分析結果與其散布圖相似，為T、GY群體歐式距離最短首先聚為一支，然后與G群體聚為一支，之后再與H群體聚為一支，但聚類分析將C和Y聚為一支(圖1.b)。雄蟹中，H群體與其余群體重疊程度較低，差異明顯，Y、T群體重疊程度較高，GY、C、G群體重疊程度較高，不易區分(圖1.c)。聚類分析將H、Y、T群體聚為一支，GY、C、G聚為一支(圖1.d)。

2.3 基于氨基酸含量的判別分析

中華絨螯蟹6個地理湖泊群體判別分析中，F檢驗判別效果均較好。雌蟹中，T、C、H、G、Y、GY群體判別準確率分別為100.00%、100.00%、75.00%、75.00%、75.00%、50%，綜合判別準確率為79.16%(表5)。雄蟹中，除GY群體判別準確率為75.00%外，其余群體均為100.00%，綜合判別準確率為95.83%(表6)。

表4 6個產地中華絨螯蟹雌雄群體氨基酸特征 因子負荷矩陣及主成分貢獻率Tab.4 Component matrix and contributive proportions of principal components on amino acids of female and male E.sinensis

圖1 6個產地中華絨螯蟹群體氨基酸主成分分析和聚類分析圖Fig.1 Principal component analysis and cluster analysis of six E.sinensis populations a：主成分分析(♀)，b：聚類分析(♀)，c：主成分分析(♂)，d：聚類分析(♂)

表5 6個產地中華絨螯蟹雌性群體氨基酸判別分析Tab.5 Discriminant analysis of amino acids in female populations of E.sinensis from six habitats %

2.4 必需氨基酸組成評價

按全雞蛋標準計算氨基酸評分結果見表7，表8。雌蟹中，中華絨螯蟹群體肌肉組織AAS除Met+Cys外，均大于1；CS值均大于或接近0.5。綜合EAAS、CS值可知Met+Cys為其限制性氨基酸，H、G群體EAAI指數與GY群體差異不顯著，與C、T、Y群體具有顯著性差異，洪澤群體AAS、CS、EAAI值最高。雄蟹中(表7)除GY群體AAS值均大于1外，其余群體Met+Cys均小于1，CS值大于或接近0.5，GY、C、G群體EAAI指數顯著高于H、T群體，G、Y群體差異不顯著，GY群體AAS、CS、EAAI值高于其他群體，且無限制性氨基酸，Met+Cys為C、G、H、T、Y群體的限制性氨基酸(表8)。

表6 6個產地中華絨螯蟹雄性群體氨基酸判別分析Tab.6 Discriminant analysis of amino acids in male populations of E.sinensis from six habitats %

表7 6個產地中華絨螯蟹雌性群體肌肉組織中必需氨基酸評分Tab.7 The essential amino acids score (EAAS) of muscle of female E.sinensis from six populations

表8 6個產地中華絨螯蟹雄性群體肌肉組織中必需氨基酸評分Tab.8 The essential amino acids score (EAAS) of muscle of male E.sinensis from six populations

2.5 肌肉組織支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的比值(F值)

中華絨螯蟹肌肉中的氨基酸種類齊全，F值比較高，具有較高的營養價值。雌蟹中，T高于Y群體必需氨基酸F值，分別為2.68、2.65，符合FAO/WHO模式(2.63)。C、G、H、GY群體F值分別為2.46、2.38、2.34、2.34、2.65，均略低于FAO/WHO模式，但高于雞蛋蛋白(2.03)。雄蟹中，C、G、GY、H、T、Y群體F值分別為2.43、2.35、2.33、2.33、2.59、2.61，均未達到FAO/WHO模式，但高于雞蛋蛋白。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹肌肉組織氨基酸組成分析

本研究對6個湖泊中華絨螯蟹肌肉組織中氨基酸組成進行分析，結果顯示，6個湖泊中華絨螯蟹均檢測出17種常規氨基酸，且谷氨酸、賴氨酸含量在各群體中均較高。王瀟等[13]研究表明谷氨酸含量在中華絨螯蟹蟹膏、肌肉組織中均較高。陳志強等[15]研究發現固城湖中華絨螯蟹肌肉組織中谷氨酸、賴氨酸含量較高。谷氨酸具有解毒和刺激腦部興奮等作用[29]，而賴氨酸則是食物中最容易缺乏的氨基酸，具有促進鈣吸收，緩解疲勞等作用[30]。因此，江蘇省內6個湖泊中華絨螯蟹具有良好的保健作用，對人體健康有利。

研究表明產地、養殖方式等的不同，其氨基酸含量等也會出現不同程度的差異[4-5]。本研究對6個湖泊中華絨螯蟹群體肌肉組織中氨基酸含量進行數據分析發現各群體間氨基酸含量差異顯著，其中雌雄群體均顯示陽澄湖與固城湖群體肌肉組織中各氨基酸指標均具有顯著性差異(P<0.05)，此結果與王瀟等[13]在對長江水域、遼河(入海口)和黃河(中上游)等水域中華絨螯蟹雌性群體營養成分及風味成分差異性研究的結果相似。

聚類分析可以直觀地表現出研究對象的差異程度，聚類的先后順序反映群體間親緣關系的遠近[31]。主成分分析是將參數綜合成少數因子來說明不同群體間差異性，并可以根據不同群體的主成分值找出各群體在主成分值上差異較大的參數[32]。王馨雨等[33]采用味道強度值(TAV)、主成分分析法及聚類分析法對不同品種百合鱗莖中游離氨基酸(Free amino acids，FAAs)綜合品質的差異進行綜合評價，結果顯示聚類分析結果與主成分綜合分析結果較一致，可反映出不同百合種質之間的差異。本研究中，綜合主成分分析和聚類分析發現中華絨螯蟹雌雄群體主成分分析散布圖與聚類分析所得群體間親緣關系遠近結果一致，一定程度上說明群體間氨基酸含量出現了差異，并將各群體間氨基酸差異更直觀地呈現出來。判別分析是群體鑒定的常用方法，它根據已知條件建立相應的判別函數，并根據所構建數據進行分類[34]，郭爽等[35]對每個品種和產地的蘋果鮮榨濁汁的氨基酸組分及含量建立判別函數發現不同品種，不同產地蘋果濁汁的樣品間差異性均較大，分別獲得了77.8%和 81.8%的判別準確率，實現了品種及產地間的差異性分析。本研究基于氨基酸含量，對6個湖泊群體進行產地判別分析，結果顯示雌雄群體間綜合判別準確率分別為79.16%，95.83%，可見能夠通過中華絨螯蟹群體間的氨基酸含量差異對其群體產地進行有效的判別。

3.2 不同產地中華絨螯蟹肌肉組織中氨基酸營養價值

蛋白質營養價值的高低，不僅在于其所含氨基酸的種類，必需氨基酸的含量及比例，是評價氨基酸營養價值的重要指標[5]。張彤晴[17]對不同增養殖水體長江水系中華絨螯蟹必需氨基酸的CS、AAS、EAAI以及人體所需支芳值進行比較發現在不同增養殖水體中長江天然雄蟹、湖泊放流雌蟹可食部位營養品質最好。根據FAO/WHO的理想模式，組成蛋白質的氨基酸中EAA/TAA在0.40左右，EAA/NEAA在0.60以上[36]，EAAS高于1.00，CS值高于0.50，則被認為是質量較好的蛋白質，容易被完全吸收，其營養價值較高[37]。EAAI可反映必需氨基酸含量與標準蛋白質含量的接近程度[38]，EAAI 高于0.95，表示為優質蛋白源；EAAI 0.86-0.95，表示為良好蛋白源；EAAI 0.75-0.86，表示為可用蛋白源；EAAI 低于 0.75 則表示為不適蛋白源[39-40]。本研究對6個湖泊中華絨螯蟹肌肉組織中氨基酸的各項指標進行分析發現，中華絨螯蟹雌雄群體中，EAA/TAA、EAA/NEAA、AAS、CS值均接近或符合FAO/WHO標準模式，均為優質蛋白源或良好蛋白源，除高郵湖雌蟹無限制性氨基酸外，其余群體限制性氨基酸均為蛋氨酸+半胱氨酸，洪澤湖雌蟹、高郵湖雄蟹營養價值最高。朱青順等[18]對江蘇太湖、陽澄湖、滆湖、長蕩湖、固城湖、洪澤湖、高寶湖、大縱湖八大養殖品牌中華絨螯蟹測試分析結果顯示，滆湖群體中華絨螯蟹EAAI指數最高，洪澤湖群體最低，蛋氨酸+半胱氨酸為第一限制性氨基酸，第二限制性氨基酸為纈氨酸或者異亮氨酸，與本研究結果均不太符合，可能是因為本研究以中華絨螯蟹肌肉組織為對象對其氨基酸營養價值進行評價，而朱青順等[18]將中華絨螯蟹可食部位混合所得。王秀莉等[41]對安徽3類淡水水產品品質進行分析發現，中華絨螯蟹的氨基酸含量分布在蟹肉、蟹黃和蟹膏中具有明顯差異。支鏈氨基酸具有降低膽固醇和抑癌保肝等功能，人類的正常F值范圍為3.00～3.50，當肝臟受到損傷時，其值范圍降為1.00～1.50[42]。本研究測得6湖泊中華絨螯蟹必需氨基酸F值與人體所需進行比較發現，中華絨螯蟹雌雄群體F值均高于人體肝臟受損傷時的F值范圍，表明6湖泊中華絨螯蟹均具有良好的保肝和降低膽固醇作用。

綜上，江蘇6個地理湖泊中華絨螯蟹雌雄群體肌肉組織中氨基酸種類齊全，氨基酸含量存在顯著性差異，且氨基酸之間的比例適宜，F值較高，具有較高的營養價值，均為優質或良好蛋白源，洪澤湖雌蟹，高郵湖雄蟹肌肉組織中氨基酸營養價值最高，基于中華絨螯蟹群體間的氨基酸含量可對其群體進行有效的判別；在后續研究中，我們還需通過增加樣本量及更多地理群體，完善統計方法，增加遺傳因素分析，增加中華絨螯蟹可食部位比較等，以期更全面地了解中華絨螯蟹群體間氨基酸含量及營養價值差異性，將有助于進一步開展中華絨螯蟹群體鑒別方法，為中華絨螯蟹氨基酸營養價值評價等研究提供數據支撐。