白洋淀水域夏季細菌群落結構及與環境因子的關系

羅同陽，高慶華，董 聰，馬金國，王 玥，王慶慶

(河北省微生物研究所，河北保定 071051)

白洋淀位于河北省中部，是海河流域最大的淡水湖泊，也是華北地區最大的內陸淡水湖泊，水質肥美，生物繁茂，歷史上有“華北明珠”之稱[1,2]。近年來隨著人民生活水平提高，白洋淀旅游業發展迅速，但是由于盲目擴張，開發過程中缺乏科學的規劃以及管理，水域生態系統受到過多的人為因素干擾，湖水質量惡化，生態系統受到破壞[3]。尤其是在夏季，由于氣溫升高，水中浮游動物、浮游植物以及魚、蝦等水生生物生長旺盛，會產生大量代謝物，加之隨著降水量增多，周圍工業廢水和生活污水隨地表徑流進入湖中，加重水體污染。

在水生生態系統中，微生物群落是生物地球化學循環的基礎結構，對微生物群落結構演變的研究和評價非常重要[4]。細菌是微生物的重要組成部分，其在水環境中的作用十分重要，它們能夠把有機物礦化成能被浮游植物利用的無機化合物，并且是水生食物網中的重要營養環節，其群落的豐度和多樣性直接受水體環境的影響，能在一定程度上反映湖泊生態系統的健康情況[5]。但是目前對于白洋淀的研究主要為浮游動物、浮游植物多樣性，水環境現狀分析[6-8]等方面，對于水體微生物的研究較少。近年來分子生物學發展迅速，通過高通量測序能夠快速準確地獲得樣品中微生物群落的組成[9]，因此，本研究通過16S rDNA擴增子測序分析技術，對白洋淀夏季水域進行采樣，解析水體細菌群落分布特征并與環境因子進行關聯分析，以期為白洋淀環境監測和污染防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 采樣點布設

于2019年8月份，結合白洋淀水域情況，水樣調查共設置8個采樣點，如圖1所示，燒車淀(SCD)位于淀區最北部，水面開闊，棗林莊(ZLZ)為淀區出水口，這兩地距離污染源較遠，受人為活動干擾小，水質較好；圈頭(QT)、光淀(GD)、采浦臺(CPT)和端村(DC)屬于典型水上村落，水產養殖業較發達；王家寨(WJZ)是白洋淀旅游景區，受人為活動影響較大；南劉莊(NLZ)為污水性河流入口，水質較差。

1.2 樣品的采集

采集方法為使用1 L有機玻璃采水器(型號為WB-PM，北京普利特儀器有限公司)在水域表層、中層、底層各采集2 L水樣，6 L水樣混合均勻后采集2 L水樣作為一個處理，每個采樣點共三個處理。

圖1 白洋淀采樣點布設Fig.1 Sampling sites map of the Baiyangdian lake 1.SCD；2.GD；3.NLZ；4.WJZ；5.ZLZ；6.QT；7.CPT；8.DC

1.3 水質指標的測定

采用便攜式pH計(型號為pH5F平面筆式pH計，上海三信儀表廠)現場測定水溫(T)及pH，塞氏盤法測定透明度(SD)。其他指標在樣品帶回實驗室24 h內進行測定。溶解氧(DO)采用GB7489-1987《水質 溶解氧的測定 碘量法》，生化需氧量(BOD5)依據HJ 505-2009《水質 五日生化需氧量(BOD5)的測定 稀釋與接種法》標準進行測定。化學需氧量(COD)、總磷(TP)和總氮(TN)通過紫外可見智能型多參數水質分析儀測定(型號為LH-3BA，華聯科技)。

1.4 數據處理與分析

試驗數據用Excel處理后，采用SPSS軟件的One-way ANOVA程序進行顯著性分析，多重比較采用Duncan方法檢驗，P<0.05為差異顯著，測定結果以“平均值±標準差”表示。

1.5 DNA的提取及高通量測序

取1 L水樣通過微孔濾膜(直徑50 mm，孔徑0.22 mm)進行抽濾。抽濾過后的濾膜收集于無菌培養皿中，存放干冰盒內。每個采樣點三個處理的濾膜合并為一個樣本送至諾禾致源公司(天津)進行樣品基因組DNA提取、16S rDNA基因擴增和測序，并對數據進行多樣性分析。

DNA的提取和PCR擴增：采用SDS方法對樣本基因組DNA進行提取，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，將提取得到的DNA進行稀釋備用。PCR擴增及其高通量測序采用細菌引物為(515F和806R)，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進行PCR。

PCR產物的混樣和純化：PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

文庫構建和上機測序：使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用Illumina NovaSeq6000進行上機測序。

2 結果與分析

2.1 水質理化性質分析

由表1可以看出，白洋淀夏季各采樣點水溫基本在25 ℃，差異不大，平均pH為7.95，為偏堿性湖泊。采樣點之間SD差異顯著，SCD和ZLZ兩地透明度較高，均超過100 cm，水質較清澈。各采樣點DO含量較高，平均值可達16.67 mg/L。COD含量在12.04～65.47 mg/L波動，WJZ含量最低。BOD5含量為1.26～5.43 mg/L，SCD、CPT和DC含量相對較高，與其他地區差異顯著。TN的濃度在1.11～4.71 mg/L之間波動，含量最高水域為NLZ，差異顯著，最低為SCD。不同樣點間TP濃度差異也較大，在0.025～0.145 mg/L之間波動，DC含量最高，ZLZ含量最低。

2.2 細菌多樣性分析

Alpha多樣性指數可以反映出樣本內的微生物群落多樣性。Coverage指數代表測序對物種的覆蓋度，表2中Coverage指數均大于0.99，說明樣本測序結果可以反映樣品的真實情況。稀釋曲線(圖2)基本趨于平緩，也反映出測序深度達到要求，可信度較高。Chao1指數和Ace指數常用于物種豐富度的評價，由表可以看出白洋淀整體細菌群落豐富度較高，其中GD地區細菌豐富度最高，QT地區豐富度最低。Shannon指數和Simpson指數通常被用來評價微生物群落多樣性，Shannon指數越高，物種多樣性越好，穩定性越強；Simpson指數越高，群落多樣性越低，穩定性越差[10]。表中可以看出Shannon指數較高，為7.151～8.443，Simpson指數較低，為0.986～0.992，說明白洋淀各采樣點微生物群落多樣性較豐富，穩定性較好，且同樣以GD地區多樣性最為豐富。

表1 白洋淀水質理化指標Tab.1 Physical and chemical properties of Baiyangdian lake

表2 白洋淀水域細菌群落的α-多樣性指數Tab.2 Microbial α-diversity index of samples in each station of the Baiyangdian lake

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of OTU number

2.3 細菌群落結構特征

如圖3所示，白洋淀細菌序列主要分布于10個菌門中，其中變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)之和在各個樣品中可達90%以上。各采樣點中變形菌門(Proteobacteria)均為第一優勢門類，占全細菌群落的44.15%～60.18%。QT地區厚壁菌門(Firmicutes)為第二優勢菌，豐度為23.34%，但在其他采樣點，該菌含量均較低。龐微菌門(Verrucomicrobia)相對于各采樣點之間，在SCD和CPT地區含量較高，豐度分別為5.45%和5.67%。其他被檢測到的主要優勢菌門還有綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)。

圖3 門水平物種群落組成Fig.3 Community composition of phylum level

在屬水平上，白洋淀各采樣點檢測到的細菌主要屬于變形菌門，且豐度差異較大(表3)。除QT地區外，其余采樣點基本以unidentified_Cyanobacteria、多核桿屬(Polynucleobacter)和Limnohabitans為主要優勢菌屬，其中WJZ地區三者豐度之和最大，為22.17%，GD地區三者豐度之和最小，為11.53%。而QT地區以奈瑟菌屬(Neisseria)和嗜血桿菌屬(Haemophilus)為主要優勢菌屬，豐度之和達9.65%。ZLZ地區鏈球菌屬(Streptococcus)含量最高，豐度為5.46%，GD地區地桿菌屬(Geobacter)含量相比其他地區較高，豐度為4.80%。其他檢測到的菌屬主要還有Vogesella，噬氫胞菌屬(Hydrogenophaga)和產乙醇桿菌屬(Ethanoligenens)。較為特殊的是在SCD地區和CPT地區均未檢出嗜血桿菌屬(Haemophilus)，且CPT地區還未檢出鏈球菌屬(Streptococcus)。

表3 屬水平上物種群落組成/%Tab.3 Community composition of genus level/%

2.4 環境因子分析

通過R軟件(Version 2.15.3)進行CCA分析，在門水平上構建了白洋淀細菌群落與環境變量之間的關系。如圖4所示，第一主軸與第二主軸對細菌群落相對豐度方差的解釋占比分別為73.42%和17.96%，兩者共解釋91.38%的方差變化，表明細菌群落和環境變量之間關系可靠。DO和pH對細菌群落結構分布影響較大，DO與第一、第二排序軸的相關性分別為-0.3716、0.9284，藍細菌門、擬桿菌門和龐微菌門受其影響較大，存在負相關性。pH與第一、第二排序軸的相關性分別為-0.6527和-0.7576。pH和與變形菌門呈顯著性負相關，與龐微菌門呈現正相關性。

3 討論

3.1 水質分析

白洋淀湖泊水體溶氧整體較高，說明水體自凈能力較好[11]。在對白洋淀水質進行分析后發現，該水域整體呈堿性，QT、CPT、DC相比其他采樣點水質更偏堿性，且TN和TP含量也相對較高， 更適宜藻類繁殖[12-14]，導致水體SD較低。夏季是漁業網箱養殖的旺季，大量魚蟹餌料的投入會引起有機耗氧量的增加導致COD的升高[15]，QT、CPT和DC水產養殖業較發達，因而COD含量更高。

圖4 白洋淀細菌與環境因子CCA分析Fig.4 CCA of bacterial and environmental factors in Baiyangidna lake

SCD由于位于最北部，水面開闊，水生植物較多，能快速吸收氮磷等營養物，分解有機污染物[16]，水體TN和TP含量較低，SD較高，水質較好。

3.2 細菌群落結構分析

α-多樣性指數是反映微生物多樣性的綜合性指標，豐富度指數和多樣性指數尤為重要。與鄱陽湖和北海湖細菌多樣性相比[17,18]，白洋淀Ace指數、Chao1指數和shannon指數均較高，表明白洋淀水域細菌豐富度和多樣性較好。

通過高通量測序，對白洋淀水域細菌群落結構分布特征進行了研究，發現該地區不同水域細菌群落組成結構相似，優勢菌門主要有變形菌門、厚壁菌門、藍細菌門、擬桿菌門和放線菌門，這些都屬于典型的淡水細菌門類，其他研究水體細菌群落結構的文獻結果相似，但在屬水平上，不同地區差異較大[19-21]。

變形菌門是水環境中普遍存在的一種原核生物，有研究指出在濕地、污染河流和深海沉積物等環境中以第一優勢門存在[22-24]，在本研究中同樣表現為相對豐度最高的優勢菌門。在屬水平上，Limnohabitans作為主要的優勢菌屬，TP和TN有利于其生長繁殖[18]，間接反映出水體TP、TN含量較高。本試驗結果還顯示藍細菌的相對豐度較高，是由于其嗜高溫的特性使其在夏季大量繁殖[25,26]。除此之外藍細菌在水體自凈中也可起到積極作用，能夠吸收水體中氮、磷等無機物，可作為水體富營養化的指示生物，因此一定程度上也可表明白洋淀水體中氮、磷等含量較高。除此之外檢測出的厚壁菌門和龐微菌門也均是富營養化水體中常見的細菌[27,28]。白洋淀水中還檢測到存在于人和動物體內的一些致病菌，例如擬桿菌門以及進一步檢測到的鏈球菌屬、奈瑟菌屬和嗜血桿菌屬[29,30]，且所占比例均相對較高，說明該區域受人為活動的影響較大。

4 結論

本研究通過對白洋淀水域的細菌宏基因組16S rDNA測序及OTUs分子生物信息分析表明，不同采樣點水體中細菌均具有較高的豐富度和多樣性，穩定性較好，且以光淀(GD)地區多樣性最為豐富。在門分類水平上，變形菌門、厚壁菌門 、藍細菌門、放線菌門和擬桿菌門為白洋淀水域主要優勢菌門，平均豐度之和能達到90%，變形菌門為第一優勢門類；屬水平上以unidentified_Cyanobacteria、多核桿屬和Limnohabitans為主要優勢菌屬。CCA分析結果顯示DO和pH是影響白洋淀細菌群落分布的主要環境因子。