玉米秸稈AFEX預(yù)處理纖維素酶解特性研究

李駿寶 陸敏生 張海燕 韓魯佳

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 北京 100083)

0 引言

木質(zhì)纖維類生物質(zhì)年產(chǎn)量大、分布廣，是制取纖維素乙醇的主要原料[1]。木質(zhì)纖維類生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成[2]，纖維素被包裹在共價相連的木質(zhì)素和半纖維素中，導(dǎo)致用酶水解法制取纖維素乙醇時降解率低，大大影響了乙醇的產(chǎn)率[3]。因此，在酶水解前需對木質(zhì)纖維類生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，以降低其抗降解特性，提高纖維素的酶可及度，從而提高酶水解效率。

文獻(xiàn)[4]指出，理想的預(yù)處理方法能最大限度地脫除木質(zhì)素、減少多糖的改性，從而保留原始的微纖絲結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素是對木質(zhì)纖維類生物質(zhì)酶水解效率影響較大的因素，其主要抑制機(jī)制是木質(zhì)素填充在纖維素和半纖維素的網(wǎng)絡(luò)中，在空間上阻礙了纖維素酶和纖維素的接觸，并能與纖維素酶發(fā)生非生產(chǎn)性吸附[5]。木質(zhì)素解聚后產(chǎn)生的水溶性酚類物質(zhì)還會與纖維素酶形成沉淀復(fù)合物，從而不可逆地抑制纖維素酶的活性[6]。但是，不同原料及其預(yù)處理方法和預(yù)處理?xiàng)l件的產(chǎn)物往往不同，對木質(zhì)素解聚產(chǎn)生的酚類物質(zhì)的影響也不同[7]。

氨纖維膨脹(AFEX)預(yù)處理是一種有效的預(yù)處理方法，國內(nèi)外已開展了大量系統(tǒng)的研究工作，研究表明，AFEX預(yù)處理能有效地破壞細(xì)胞壁的亞顯微結(jié)構(gòu)，切斷木質(zhì)素與多糖的連接，并使半纖維素和木質(zhì)素部分解聚，對纖維素產(chǎn)生消晶作用，去除半纖維素側(cè)鏈上的乙酰基，從而提高纖維素的酶可及度和酶水解效率[6-8]。此外，AFEX預(yù)處理工藝還具有固體加載率高、不需水洗、絕大多數(shù)氨可回收、殘留在物料中的氨能為發(fā)酵過程提供氮源等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。文獻(xiàn)[11]指出，雖然AFEX預(yù)處理后的木質(zhì)纖維物料的木質(zhì)素總量變化不顯著，但木質(zhì)素的溶解性顯著提高。文獻(xiàn)[12]研究分析了AFEX預(yù)處理柳枝稷木質(zhì)素物化性質(zhì)的變化及其對酶解的影響，結(jié)果表明，AFEX預(yù)處理柳枝稷木質(zhì)素的分子量、聚合度、紫丁香基與愈創(chuàng)木基的比例均有所提高，木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附降低，對酶解過程的抑制作用隨之減小，從而使酶解效率提高。文獻(xiàn)[13]采用超速離心、超濾、固相萃取技術(shù)對AFEX預(yù)處理上清液中不同分子量的產(chǎn)物進(jìn)行分離，并分析了它們對纖維素酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)主要的抑制作用系由上清液中的低聚物(3～10 ku或0～3 ku)產(chǎn)生，并且大部分抑制物為疏水結(jié)構(gòu)，其中含有許多酚類物質(zhì)，推斷酚類物質(zhì)可能是AFEX預(yù)處理上清液產(chǎn)生抑制作用的重要成分。上述研究均未涉及AFEX預(yù)處理木質(zhì)素對酶解的空間阻礙作用以及產(chǎn)生的酚類物質(zhì)對后續(xù)酶解的影響。

本文以玉米秸稈為原料，進(jìn)行高低兩個溫度條件的AFEX預(yù)處理，基于孔徑分布、表面形貌、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和纖維素、木質(zhì)素表面積的變化，研究AFEX預(yù)處理后木質(zhì)素對酶解的空間阻礙作用以及產(chǎn)生的酚類物質(zhì)對后續(xù)酶解的影響。

1 材料與方法

1.1 玉米秸稈及酶制劑

玉米秸稈取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站(40°2′N, 116°20′E)。采集的玉米秸稈樣品置于空曠通風(fēng)處自然風(fēng)干后進(jìn)行機(jī)械粉碎(9ZP-0.4型粉碎機(jī)，遼寧鳳城縣東風(fēng)機(jī)械廠)，在40℃恒溫干燥箱中干燥48 h，使用RT-34型錘片式粉碎機(jī)(香港榮聰精密科技有限公司)粉碎至秸稈粉末全部通過40目振動篩，得到玉米秸稈制備樣品(CK)，置于自封袋中在干燥通風(fēng)處室溫(20℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)所用纖維素酶(Celluclast 1.5 L)和β-葡萄糖苷酶 (Novozyme 188)均購自美國Sigma-Aldrich公司。纖維素酶酶活的測定參照美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室的濾紙酶活法[14]，β-葡萄糖苷酶的酶活測定參照文獻(xiàn)[15]的方法，測得纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的酶活分別為72.8 U/mL和385.5 U/mL。

1.2 玉米秸稈AFEX預(yù)處理

已有相關(guān)文獻(xiàn)表明，AFEX預(yù)處理酶解的效果隨著處理溫度的上升(從90℃升至140℃)而顯著增加[12,16]。為便于分析，本研究選取文獻(xiàn)中的高、低兩個極端AFEX預(yù)處理?xiàng)l件(90℃、5 min和140℃、15 min)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12,16]，即：預(yù)處理在Parr 4523型反應(yīng)釜(美國Parr Instruments公司)中進(jìn)行。每1 g CK與0.6 g 水混合，氨的加載量為1 g/g(以單位質(zhì)量玉米秸稈計(jì))，一組在90℃下恒溫處理5 min(L-AFEX)，另一組在140℃下恒溫處理15 min(H-AFEX)，然后迅速打開泄壓閥排出氨氣，取出樣品置于通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干后于60℃干燥箱中干燥。干燥的AFEX預(yù)處理樣品于自封袋中封存待用。

1.3 酶解試驗(yàn)

1.3.1AFEX預(yù)處理玉米秸稈的酶解試驗(yàn)

為了考察AFEX預(yù)處理對玉米秸稈酶解效果的影響，AFEX預(yù)處理玉米秸稈的酶解試驗(yàn)在pH值4.8的50 mmol/L檸檬酸緩沖液中進(jìn)行，料液比為0.05 g/mL，纖維素酶加載量為20 U/g，β-葡萄糖苷酶加載量為40 U/g，為避免酶解過程中微生物的干擾，添加四環(huán)素鹽酸鹽至0.08 g/L。酶解72 h后，將樣品取出置于沸水浴中10 min使纖維素酶滅活，利用抽濾進(jìn)行固液分離，用適量的去離子水沖洗固體殘余物3次，收集、混勻所有濾液(記為酶解液)并記錄其體積。取部分酶解液用CaCO3調(diào)節(jié)pH值至5～6保存?zhèn)溆茫糜谄咸烟堑寐实臋z測。酶解試驗(yàn)設(shè)置3組平行。

利用Hitachi L-7200型高效液相色譜儀(日本Hitachi公司)測定酶解液中單糖濃度，色譜柱使用Benson BP-800 Pb++型碳水化合物分析柱 (美國Benson Polymeric公司)，流動相為超純水，流速為0.6 mL/min，柱溫為80℃，進(jìn)樣體積20 μL，洗脫時間為40 min。單糖得率計(jì)算公式為

(1)

式中mE——酶解72 h后產(chǎn)出單糖的質(zhì)量，mg

mP——不同底物中可轉(zhuǎn)化成單糖的最大質(zhì)量，mg

1.3.2酚類物質(zhì)對酶解的影響

不同分子量的酚類物質(zhì)都會對酶解產(chǎn)生抑制效果[17]，而這些酚類物質(zhì)由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜很難定量[18]，所以直接測定不同分子質(zhì)量的酚類物質(zhì)對酶解的抑制效果比較困難。故本文利用活性炭對各上清液中的酚類物質(zhì)進(jìn)行脫除，用活性炭吸附前后的預(yù)處理上清液稀釋纖維素酶，并用稀釋后的酶水解纖維素濾紙，測定產(chǎn)糖量來表征預(yù)處理過程中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)對纖維素酶水解能力的影響。取無磷活性炭(Activated carbon，AC，上海迪柏化學(xué)品技術(shù)有限公司)，用大量去離子水和異丙醇沖洗[19]，再于通風(fēng)櫥自然風(fēng)干后置于105℃干燥箱中干燥至絕干。為了研究AFEX預(yù)處理產(chǎn)生的酚類物質(zhì)對酶解的作用，分別將CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈樣品與pH值4.8的檸檬酸緩沖液按料液比0.05 g/mL混合，在50℃水浴中150 r/min振蕩1 h，3 000 r/min離心15 min得上清液，并用0.22 μm的濾膜過濾。各上清液中的葡萄糖、甲酸、乙酸、乙醇、糠醛和羥甲基糠醛濃度的測定參照方法NREL/TP-510-42623[20]。取部分上清液與0.05 g/mL經(jīng)清洗處理的AC(30℃，200 r/min，16 h)脫除酚類物質(zhì)[17]。試驗(yàn)設(shè)置2組平行。參照文獻(xiàn)[21]的方法測定脫除酚類物質(zhì)前后上清液中總酚類物質(zhì)(Total phenolic component，TPC)的含量，上清液中TPC的脫除率計(jì)算公式為

(2)

式中mi——脫除酚類物質(zhì)前上清液中TPC質(zhì)量，mg

mf——脫除酚類物質(zhì)后上清液中TPC質(zhì)量，mg

用脫除酚類物質(zhì)前后的上清液將纖維素酶稀釋70倍(約為10 U/g)，以pH值4.8的檸檬酸緩沖液將纖維素酶稀釋70倍作對照，分別將0.5 mL稀釋的酶液、1.0 mL檸檬酸緩沖液和50 mg Whatman No.1濾紙于15 mL具塞試管中混合并于50℃水浴中恒溫1 h，而后加入3 mL DNS(二硝基水楊酸)顯色液終止反應(yīng)并于沸水浴中恒溫5 min顯色，用蒸餾水將顯色后的液體稀釋一定倍數(shù)后用UV-2550型分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)在540 nm下測定吸光度。上清液對纖維素濾紙水解的抑制率計(jì)算公式為

(3)

式中PCBS——檸檬酸緩沖液稀釋的纖維素酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量，mg

Ps——上清液稀釋的纖維素酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量，mg

由于玉米秸稈的構(gòu)成比纖維素濾紙復(fù)雜得多，且AFEX對玉米秸稈的結(jié)構(gòu)造成了較大改變，故再用分散在檸檬酸緩沖液和AC吸附前后的預(yù)處理上清液中的CK、L-AFEX及H-AFEX預(yù)處理固體殘余物的酶解葡萄糖得率來表征不同上清液中的酚類物質(zhì)對酶解相應(yīng)固體殘余物的抑制作用。

每種提取上清液后的預(yù)處理固體殘余物用檸檬酸緩沖液沖洗3遍并分成3組，分別被檸檬酸緩沖液及相應(yīng)的AC吸附前后的預(yù)處理上清液沖洗3遍后再以0.05 g/mL的料液比分散。而后加入20 U/g 的纖維素酶和40 U/g 的纖維二糖酶。用不同上清液與酶的混合物做空白。將樣品和空白置于50℃、150 r/min的恒溫水浴振蕩器中酶解72 h，取出后于沸水浴中恒溫10 min滅酶，而后3 000 r/min離心15 min。收集上清液，用液相測定其中的葡萄糖濃度，抑制率的計(jì)算方法與式(3)相似。

1.4 木質(zhì)纖維成分分析

纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量的測定參照文獻(xiàn)[22]，測定前樣品于105℃干燥箱中干燥至絕干。木質(zhì)素含量為酸溶木質(zhì)素含量和酸不溶木質(zhì)素含量之和。每個樣品分析設(shè)置2個重復(fù)。

1.5 微結(jié)構(gòu)分析

1.5.1孔徑分布

利用溶質(zhì)排斥的方法對樣品的孔徑分布進(jìn)行分析。以葡萄糖、葡聚糖T2000(Dextran T2000)和一系列的聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)為分子探針，各探針分子的相對分子質(zhì)量和直徑如表1[23-24]所示，每個探針分子設(shè)置2個重復(fù)。試驗(yàn)步驟主要參照文獻(xiàn)[23]，并稍作修改：將CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理樣品用大量去離子水沖洗至濾液無色中性，將樣品抽濾至固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)近20%的濕樣，測定濕樣的干質(zhì)量。稱取1.0 g濕樣于離心管中，加入2 mL質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的探針分子溶液于室溫下混合2.5 h，其間每0.5 h振蕩30 s。將樣品與探針的混合物于3 000 r/min下離心10 min，取上清液過0.45 μm的尼龍膜，每個樣品設(shè)置2組平行，并以水與濕樣混合后的上清液作為樣品空白。上清液中分子探針的濃度用裝備有Waters 2414型示差檢測器(美國Waters公司)的Waters e2695型高效液相色譜儀檢測，進(jìn)樣器和檢測器之間用一個直通接頭代替分析柱，流動相為超純水，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL。

表1 探針分子的相對分子質(zhì)量和直徑Tab.1 Relative molecular masses and diameters of probes

單位干質(zhì)量濕樣中直徑為i的分子探針不可進(jìn)入的孔的體積di計(jì)算公式為[25]

(4)

式中W——探針溶液體積，mL

q——濕樣中水體積，mL

p——濕樣干質(zhì)量，g

Ci——探針溶液的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

Cf——上清液中探針溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

葡聚糖T2000的粒徑為56 nm，d56nm被認(rèn)為是總的不可進(jìn)入的孔的體積，故單位干質(zhì)量濕樣中粒徑為i的分子探針可進(jìn)入的孔的體積Ai計(jì)算公式為

Ai=d56nm-di

(5)

1.5.2表面形貌

使用Hitachi SU-3500型掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope，SEM；日本Hitachi公司)分析不同樣品的表面形貌。測試前需先將適量樣品固定于粘有黑色導(dǎo)電膠的載物臺上，并作噴Au處理，時間為60 s。測試時加速電壓為15 kV。

1.5.3細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)

挑選各樣品中包含有厚壁細(xì)胞包圍的維管束結(jié)構(gòu)的顆粒，利用Hitachi H-7650B型透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope，TEM)觀察這些顆粒的橫截面，分析AFEX預(yù)處理后玉米秸稈細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化。觀察時，TEM的加速電壓為80 kV。用于TEM觀察的超薄切片樣品的制作過程及超薄切片的乙酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色的操作流程同文獻(xiàn)[26]。

1.5.4纖維素、木質(zhì)素表面積

同文獻(xiàn)[27]，通過測定剛果紅和天青B與樣品的最大吸附量來估算樣品中纖維素和木質(zhì)素的表面積。兩種染料與樣品的最大吸附量在Matlab 2014a中用Langmuir等溫線擬合而得。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本文所列數(shù)據(jù)均為統(tǒng)計(jì)平均值，誤差由計(jì)算數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差得到，均值的差異顯著性檢驗(yàn)借助SPSS 20.0，基于Duncan單因素方差檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平為99%(P<0.01)。柱狀圖和折線圖的制作均借助Origin 8.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 AFEX預(yù)處理玉米秸稈的酶解效果

如圖1所示，酶解72 h后，CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈葡萄糖得率分別為(26.18±0.57)%、(37.57±0.01)%和(74.74±0.07)%，木糖和阿拉伯糖得率分別為(5.59±0.17)%、(26.05±0.23)%和(76.63±0.20)%。可以看出，AFEX預(yù)處理對玉米秸稈酶解效果的改善隨預(yù)處理?xiàng)l件的升高而增強(qiáng)。文獻(xiàn)[16]用與本研究H-AFEX預(yù)處理相同的條件處理了玉米秸稈，再用優(yōu)化的混合酶酶解72 h，得到了近80%的葡萄糖得率，結(jié)果與本研究相近。從圖1中還可看出，經(jīng)過AFEX預(yù)處理的玉米秸稈在酶解時的葡萄糖得率、木糖和阿拉伯糖得率均得到顯著提高，而相對于葡萄糖得率，預(yù)處理?xiàng)l件的增強(qiáng)對酶解時木糖和阿拉伯糖得率的影響更為顯著。這可能是由于半纖維素在AFEX預(yù)處理過程中會發(fā)生解聚[9]，且半纖維素為非晶態(tài)，更容易在酶解過程中被降解。

2.2 AFEX預(yù)處理前后木質(zhì)纖維成分的變化及其對酶解的影響

如表2所示，CK中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(35.16±0.10)%、(19.01±0.05)%和(18.82±0.58)%。AFEX預(yù)處理后，玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量均無顯著變化(P>0.01)。但是，隨著預(yù)處理?xiàng)l件的增強(qiáng)，酸溶木質(zhì)素含量顯著升高(P<0.01)，酸不溶木質(zhì)素含量顯著降低(P<0.01)。這與文獻(xiàn)[11]的結(jié)果一致，其認(rèn)為酸不溶木質(zhì)素的降低可能源于AFEX預(yù)處理對木質(zhì)素的化學(xué)改性。根據(jù)文獻(xiàn)[28]，酸溶木質(zhì)素可能是由木質(zhì)素降解產(chǎn)物和次生的親水物質(zhì)(木質(zhì)素和碳水化合物形成的化合物)組成。這說明AFEX預(yù)處理會提高玉米秸稈中部分木質(zhì)素的親水性，由于疏水相互作用是木質(zhì)素與纖維素酶之間發(fā)生非生產(chǎn)性吸附的主要作用機(jī)制[29]，那么這部分木質(zhì)素與纖維素之間發(fā)生非生產(chǎn)性吸附的能力也就變?nèi)酢４送猓诟魃锨逡褐芯礄z出甲酸、乙醇、糠醛和羥甲基糠醛。AFEX預(yù)處理僅產(chǎn)生了少量乙酸(CK：(0.06±0.01) mg/mL；L-AFEX：(0.10±0.01) mg/mL；H-AFEX：(0.22±0.01) mg/mL)。根據(jù)先前的研究，乙酸對酶解幾乎無影響[30]。

表2 AFEX預(yù)處理前后玉米秸稈的木質(zhì)纖維成分含量Tab.2 Lignocellulosic composition contents of corn stover before and after AFEX pretreatment

2.3 AFEX預(yù)處理產(chǎn)生的酚類物質(zhì)及其對酶解的影響

AC吸附前后，上清液中TPC的變化如表3所示。可以看出，AFEX預(yù)處理后上清液中TPC含量顯著增加(P<0.01)，且隨AFEX預(yù)處理?xiàng)l件的增強(qiáng)，TPC含量也顯著增加(P<0.01)。文獻(xiàn)[31-32]中也得到了類似的結(jié)果。AC吸附后CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理樣品上清液中TPC的脫除率分別為96.14%、98.72%和98.95%。

表3 AC吸附前后上清液中TPC含量Tab.3 TPC contents in different supernatants before and after AC adsorption

圖2為AC吸附前后上清液對纖維素濾紙酶解效果的影響，“CBS”為對照組，為pH值4.8的檸檬酸緩沖液稀釋的酶液，標(biāo)有“S”的是纖維素酶與不同上清液混合，標(biāo)有“AC”的是經(jīng)AC脫除酚類物質(zhì)的上清液稀釋的酶液。以pH值4.8的檸檬酸緩沖液稀釋的酶液作為對照，經(jīng)計(jì)算得CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理上清液對纖維素濾紙酶解的抑制率分別為28.04%、4.10%和10.40%，差異極顯著(P<0.01)。但是，上清液脫除酚類物質(zhì)后，L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理上清液對水解均未產(chǎn)生顯著的抑制作用(P>0.01)。在不同預(yù)處理過程中產(chǎn)生的纖維素酶可溶性抑制物主要有可溶性糖(如葡萄糖、纖維二糖)、發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)和酚類物質(zhì)[33]。CK上清液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為(2.51±0.14) mg/mL，L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理上清液中均未檢出葡萄糖，且各上清液中均未檢出乙醇。CK上清液中TPC含量最低但抑制率最高，可能是因?yàn)镃K中有相當(dāng)量的游離葡萄糖，這些葡萄糖作為酶解產(chǎn)物會抑制纖維素酶的水解能力[33]。以上表明，酚類物質(zhì)是AFEX上清液中抑制纖維素酶水解能力的主要成分。脫除酚類物質(zhì)后，CK上清液的抑制率降低為17.43%，但依然大于脫除酚類物質(zhì)前L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理上清液的抑制效果。

圖3為不同上清液中酚類物質(zhì)對相應(yīng)固體殘余物酶解效果的影響，“CBS”為對照組，為分散在pH值4.8的檸檬酸緩沖液中的玉米秸稈，標(biāo)有“S”的是預(yù)處理固體殘余物分散在不同上清液中，標(biāo)有“AC”的是預(yù)處理固體殘余物分散在經(jīng)AC脫除酚類物質(zhì)的上清液中。以“CBS”為對照，用與圖2相同的方式計(jì)算不同上清液中酚類物質(zhì)對相應(yīng)固體殘余物酶解效果的抑制率。可以看出，CK和L-AFEX預(yù)處理的上清液并未對其對應(yīng)的固體殘余物的酶解效果產(chǎn)生顯著影響(P>0.01)。H-AFEX預(yù)處理上清液對H-AFEX預(yù)處理固體殘余物的酶解效果表現(xiàn)出顯著的抑制效果(抑制率8.07%)。AC吸附后，H-AFEX預(yù)處理上清液的抑制效果降低為3.01%。這說明在本試驗(yàn)條件下，H-AFEX預(yù)處理產(chǎn)生的酚類物質(zhì)對酶解的抑制率為5.06%。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果，分散在AC吸附后的H-AFEX上清液中的H-AFEX預(yù)處理固體殘余物的酶解效果與分散在檸檬酸緩沖液中的無顯著差異(P>0.01)。盡管CK的上清液對酶水解能力有較強(qiáng)的抑制力，當(dāng)酶解底物換成CK固體殘余物后，抑制作用并沒有體現(xiàn)出來。這大概是由于CK固體殘余物本身具有較強(qiáng)的抗降解特性，上清液的抑制作用被掩蓋了。H-AFEX預(yù)處理固體殘余物具有較理想的纖維素可及度，所以酶水解活性受到的影響就在酶解效果中體現(xiàn)了出來。

2.4 木質(zhì)素、纖維素表面暴露程度的變化及其對酶解的影響

CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈樣品中不同粒徑的分子探針可擴(kuò)散進(jìn)入的孔體積如表4所示，L-AFEX預(yù)處理玉米秸稈中葡萄糖可擴(kuò)散進(jìn)入的體積較CK無顯著差異(P>0.01)，在H-AFEX預(yù)處理后玉米秸稈中0.8 nm的探針可擴(kuò)散進(jìn)入的體積顯著增大(P<0.01)。然而，在AFEX預(yù)處理玉米秸稈中，一系列PEG分子探針可擴(kuò)散進(jìn)入的體積總體上較CK并無顯著差異(P>0.01)。0.8 nm的探針小到幾乎可以進(jìn)入所有的孔，這說明H-AFEX預(yù)處理增大了玉米秸稈中的孔的總體積，并對其中小孔體積的增加作用更為明顯。

表4 AFEX預(yù)處理前后玉米秸稈的孔徑分布Tab.4 Pore size distributions of corn stover before and after AFEX pretreatment

文獻(xiàn)[34]用5.1 nm來代表產(chǎn)自里氏木霉的纖維素酶的粒徑，并發(fā)現(xiàn)5.1 nm粒徑的分子可及的孔體積與酶水解的初始速率呈線性正相關(guān)關(guān)系。而CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈樣品中粒徑為5.0 nm的探針分子可進(jìn)入的孔體積并無顯著差異(P>0.01)。這說明，AFEX預(yù)處理并未使玉米秸稈中纖維素酶可及的孔體積(孔徑小于56 nm)發(fā)生顯著改變。

CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈樣品及其酶解72 h樣品的SEM結(jié)果如圖4所示。CK(圖4a)的表面十分平整，結(jié)構(gòu)完整緊湊。酶解72 h后(圖4b)，秸稈表面雖有些褶皺，但整體結(jié)構(gòu)并未受到破壞。說明CK中由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的致密完整的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了纖維素酶的水解作用，致使酶解效率較低(酶解糖得率26.18%)。經(jīng)過L-AFEX預(yù)處理后(圖4c)，玉米秸稈表面形貌的變化明顯，完整緊湊的結(jié)構(gòu)被破壞，比表面積升高。酶解72 h后(圖4d)，秸稈表面出現(xiàn)許多直徑幾微米的孔，但是整體結(jié)構(gòu)較酶解前變化不大，這說明L-AFEX預(yù)處理雖然對玉米秸稈空間結(jié)構(gòu)的影響作用顯著，但是對酶解效率的提高仍有限(酶解糖得率37.58%)。經(jīng)過H-AFEX預(yù)處理后(圖4e)，玉米秸稈的表面形貌發(fā)生了更大程度的改變，表面的破碎程度較L-AFEX預(yù)處理后的玉米秸稈更大，比表面積的升高也就更大。經(jīng)過72 h酶解后(圖4f)，樣品的結(jié)構(gòu)被徹底破壞，這說明H-AFEX預(yù)處理大大提高了酶解效率(酶解糖得率74.73%)。

玉米秸稈中的各類多糖和木質(zhì)素主要存在于細(xì)胞壁中，這些成分發(fā)生了顯著變化一定會改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈樣品的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如圖5所示，皆為厚壁細(xì)胞。如圖5a所示，CK的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整清晰，初生壁(Primary cell wall，PCW)、次生壁(Secondary cell wall，SCW)、細(xì)胞角隅(Cell corner，CC)及胞間層(Middle lamella，ML)堆積緊密，無明顯孔隙結(jié)構(gòu)。又根據(jù)文獻(xiàn)[35]的研究，在TEM下觀察經(jīng)過乙酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色后的樣品，木質(zhì)素會被染液中的重金屬染成深色，纖維素則顏色較淺或呈無色。CK中CC和ML的木質(zhì)素含量顯著高于PCW和SCW，這與文獻(xiàn)[35]中報(bào)道的一致。相同部位的不同位置被重金屬染色的程度都比較均一，說明相同部位中各組分排列均勻。L-AFEX預(yù)處理后(圖5b)，玉米秸稈細(xì)胞壁各部分的結(jié)構(gòu)變化并不顯著，但相同部位的不同位置被重金屬染色的程度卻不均一，尤其是PCW和SCW處均能看到明顯較亮或較暗的部分。這可能是因?yàn)椋?jīng)過L-AFEX預(yù)處理后，玉米秸稈細(xì)胞壁上原始的組分分布狀態(tài)已被打破，木質(zhì)素開始聚集，纖維素開始暴露。雖然從SEM結(jié)果看到L-AFEX預(yù)處理破壞了玉米秸稈的表面形貌，但從TEM結(jié)果來看此時細(xì)胞壁各部分的整體結(jié)構(gòu)并未被破壞。H-AFEX預(yù)處理后(圖5c)，玉米秸稈細(xì)胞壁變得扭曲褶皺，甚至被撕裂，各部位之間出現(xiàn)錯位，但并未產(chǎn)生更多的孔隙。這說明此時細(xì)胞壁各部位間的連接變得松散，這樣的結(jié)構(gòu)較CK和L-AFEX預(yù)處理玉米秸稈更容易在后續(xù)酶解過程中被進(jìn)一步破壞，就可能有更多的纖維素暴露出來，被纖維素酶水解。另外，H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈細(xì)胞壁相同部位不同位置的染色程度較L-AFEX預(yù)處理樣品顯得更不均一。從圖5c來看，在CC處、不同部位的連接處和細(xì)胞壁斷裂處能看到不同程度的木質(zhì)素的聚集。而在細(xì)胞壁中的木質(zhì)素組分發(fā)生了極為顯著的聚集，形成了輪廓鮮明的黑點(diǎn)，此時木質(zhì)素的比表面積顯著縮小。

纖維素和木質(zhì)素是木質(zhì)纖維物料中吸附纖維素酶的兩個主要成分[36-37]。通過測定剛果紅和天青B在底物上的最大吸附量，得到CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈樣品中纖維素及木質(zhì)素的表面積，如圖6所示。CK的纖維素和木質(zhì)素表面積分別為(316.08±7.01)m2/g和(293.13±1.47)m2/g，AFEX預(yù)處理后，玉米秸稈中纖維素的表面積顯著增大(L-AFEX：(430.97±2.69)m2/g，H-AFEX：(422.27±6.64)m2/g)、木質(zhì)素的表面積顯著減小(L-AFEX：(271.25±2.75)m2/g，H-AFEX：(215.23±0.37)m2/g)，而預(yù)處理強(qiáng)度對纖維素的暴露影響不顯著(P>0.01)，木質(zhì)素表面積卻隨著預(yù)處理強(qiáng)度的增強(qiáng)而顯著減小(P<0.01)。這可能與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)表征結(jié)果中在H-AFEX預(yù)處理后木質(zhì)素發(fā)生的形態(tài)和分布變化有關(guān)，此時木質(zhì)素的比表面積減小，同時木質(zhì)素在秸稈表面的聚集可能會覆蓋部分暴露的纖維素。CK、L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理玉米秸稈樣品中纖維素與木質(zhì)素表面積的比值分別為1.08、1.59和1.96，假設(shè)纖維素和木質(zhì)素在玉米秸稈表面的暴露分布均勻，由此推斷，隨著AFEX預(yù)處理?xiàng)l件的增強(qiáng)，玉米秸稈單位面積表面上纖維素酶可及的木質(zhì)素對纖維素的空間阻礙逐漸降低。

因此，AFEX預(yù)處理不僅增大了纖維素酶可及的表面積，還增大了纖維素酶可及的表面積中纖維素暴露的比例，從而有效降低了纖維素酶水解時的空間阻礙，提高了酶解效率。

3 結(jié)論

(1)從木質(zhì)纖維組成、酚類物質(zhì)和纖維素、木質(zhì)素暴露程度3方面分析了AFEX預(yù)處理后玉米秸稈的變化及其對酶解效果的影響。

(2)隨著AFEX預(yù)處理溫度的升高和時間延長，玉米秸稈中纖維素和半纖維素含量不變，酸溶木質(zhì)素增多，木質(zhì)素親水性增強(qiáng)，減弱了酶解時木質(zhì)素與纖維素酶間的非生產(chǎn)性吸附，同時產(chǎn)生了更多的酚類物質(zhì)。

(3)L-AFEX和H-AFEX預(yù)處理上清液中的TPC對纖維素酶水解能力的抑制率分別為4.10%和10.40%，TPC對H-AFEX固體殘余物的抑制率為5.06%(P<0.01)。

(4)AFEX預(yù)處理顯著增大了纖維素酶可及的表面積，將纖維素表面積從316.08 m2/g(CK)增大至430.97 m2/g(L-AFEX)和422.27 m2/g(H-AFEX)，將木質(zhì)素表面積從293.13 m2/g(CK)減小至271.25 m2/g(L-AFEX)和215.23 m2/g(H-AFEX)，使纖維素與木質(zhì)素表面積的比值從1.08(CK)增大至1.59(L-AFEX)和1.96(H-AFEX)，有效降低了木質(zhì)素對纖維素酶解的空間阻礙，提高了酶解效率。