拉曼檢測系統中微量試樣自動混勻控制裝置設計與試驗

閆 帥 李永玉 彭彥昆 韓東海 劉亞超

(1.中國農業大學工學院， 北京 100083； 2.中國農業大學食品科學與營養工程學院， 北京 100083)

0 引言

拉曼散射是一種分子散射光譜，可以反映分子機構的振動和轉動，具有特異性“指紋式”分子識別能力[1]。當分析物分子在增強基底金銀等粗糙金屬表面吸附時，入射激光沖擊金屬粗糙表面產生的局部表面等離子體共振可以顯著提高分子的拉曼散射效應，從而獲得高靈敏度的表面增強拉曼光譜[2-3]。解析表面增強拉曼光譜可以實現體系中目標物的定性和定量分析，目前在生物、化學、食品安全檢測等諸多領域已有研究和應用[4-10]。

表面增強拉曼光譜具有高度的敏感性、強大的特異性分子識別能力和不受水環境干擾的特點，只需微量液態樣品即可實現痕量檢測[11-13]。在拉曼光譜檢測過程中，拉曼散射受到分析物在底物表面吸附效果的影響，若無法保證有效均勻的表面吸附，則難以保證表面增強拉曼光譜的重復性和穩定性[14]。表面增強拉曼散射強度由金屬表面的局部電場強度、增強區內分析物的數量以及激光功率、光斑大小等因素決定[15]，表面增強劑與樣品混合的時間和均勻性差異極易造成表面增強“熱點”的分布不均，直接影響拉曼光譜檢測穩定性。另外，激光光源到樣品表面的微小距離變化將導致樣品表面激光功率以及激光斑點大小的差異[16]，對拉曼光譜穩定性影響也較大。目前，表面增強拉曼檢測中增強劑和液態樣品的混合吸附過程一般均人為操作，受主觀因素的影響，難以保證樣品和增強金屬粒子混合吸附程度的均一性和操作過程時間的一致性。自動控制表面增強劑和微量液態樣品的混勻吸附過程、提高表面增強拉曼光譜穩定性對表面增強拉曼光譜定量分析具有重要意義。

本文以提高表面增強拉曼光譜重復性為目的，為保證分析物和增強金屬納米顆粒混合吸附的均一性，基于實驗室自行搭建的拉曼光譜點檢測裝置，設計微量液態樣品和表面增強劑自動混勻控制裝置，開發基于NI LabVIEW的上位機軟件，實現微量液態樣品和表面增強劑自動混勻進樣、吸附時間及光譜采集自動控制等功能。以市售蜂蜜中硝基呋喃妥因、磺胺甲氧噠嗪兩種獸藥殘留為檢測對象，通過試驗驗證檢測系統的穩定性和可靠性，以期為液態樣品表面增強拉曼光譜快速定量檢測提供技術支持。

1 自動混勻控制拉曼光譜檢測系統設計

1.1 系統組成及檢測原理

表面增強拉曼光譜信號的穩定性與重復性受試樣與表面增強劑混勻吸附均一性影響，控制微流體的混合過程對于定性、定量分析至關重要。本文基于實驗室自行搭建的拉曼光譜點檢測裝置[17]，設計表面增強劑與微量液態樣品自動混勻控制裝置，旨在確保液態樣品和表面增強劑混勻吸附均一性，提高表面增強拉曼光譜的穩定性和重復性。所設計的表面增強劑與微量液態樣品自動混勻控制裝置通過拉曼檢測探頭與拉曼光譜點檢測裝置相連，即通過支架將拉曼光譜點檢測裝置的拉曼探頭固定于自動混勻控制裝置的樣品槽上方激光焦距處(7.5 mm)，探頭通過分叉光纖分別與激光器、光譜儀相連；CCD相機和自動混勻裝置通過USB數據線與計算機通信，上位機軟件進行光譜信號處理與控制混勻裝置機械動作，如圖1所示。

樣品槽中添加試樣和表面光增強劑后，通過自動混勻裝置上的機械按鈕或上位機軟件中開始檢測按鈕一鍵式觸發檢測過程。進出樣模塊的步進電機驅動旋轉臺帶動試樣由進樣口傳送至檢測口，同時混勻模塊通過偏振電機高速旋轉造成樣品板的振蕩使樣品槽中的試樣液滴與表面增強劑充分混勻吸附。控制模塊通過串口通訊控制單片機和接收單片機反饋信號，識別按鈕觸發，驅動步進電機驅動器和直流電機驅動器從而控制進出樣模塊與混勻模塊。當試樣到達檢測位置且完成設定時間的振蕩混勻后，單片機向上位機反饋信號，上位機控制拉曼光譜點檢測裝置采集光譜數據。各模塊的結構及連接關系如圖2所示。

1.2 硬件設計

根據連續多次測樣、自動化、微量試樣混勻、控制簡單的思路，分別設計了進出樣模塊、混勻模塊、控制系統模塊。根據光學檢測需要屏蔽外部光信號干擾的要求，將3個模塊集成于金屬殼體中，其中控制模塊的電氣部分與機械部分相互隔離，如圖3所示。裝置外側設計了樣品架便于試樣的存放，整個裝置的各部件靈活可調，拉曼探頭與支架以及檢測孔處的連接固定處設計了軟接觸保護，以免損傷光學器件。自動混勻裝置加工實物如圖4所示，整體尺寸(長×寬×高)為300 mm×200 mm×250 mm，便于光譜儀間的移植使用。

1.2.1進出樣模塊

進出樣模塊主要完成樣品輸送功能，包括樣品板、電控旋轉臺、步進電機、工位調節手輪、旋轉體5個部件，如圖5所示。為實現連續批量的測樣功能，采用了多樣品槽設計。樣品板頂面均勻分布了兩周半球形樣品槽，每周30個，通過滑板與滑槽的設計，可精確控制兩周樣品槽的切換利用。樣品板通過螺釘固定，簡單可靠，方便更換，加工多個樣品板更換使用，保障了足量樣品的檢測能力。為檢測過程的連續與自動化，使用了電控旋轉臺。利用高精度電控旋轉臺，根據設置時間精確控制樣品槽在進樣口與檢測孔之間的轉移，保證試樣滴加后操作時間的一致性，同時避免了樣品在激光下長時間照射造成的過熱、灼燒問題。表面增強劑與試樣的混合吸附時長對采集光譜信號穩定性和重復性影響非常大，同一樣品的表面增強拉曼光譜信號隨時長變化如圖6所示。

另外，光譜采集過程中激光拉曼探頭與檢測試樣的距離應保持在激光焦距約7.5 mm，而且應避免外界光的干擾，將進樣槽設置在檢測孔180°方向，通過電控旋轉臺的旋轉實現樣品輸送，如圖7所示，整個檢測過程小于30 s。步進電機連續運行會造成累積誤差，設計在裝置殼體外的工位調節手輪可微調因累積誤差造成的樣品槽位置偏移。

1.2.2混勻模塊

目前常用的混勻裝置為機械振搖式，通過電機帶動偏振塊高速旋轉振搖達到分散混勻的目的。然而現有的機械混勻裝置體積大、功能單一，難以實現微量物質的混合操作，無法滿足表面增強拉曼光譜檢測中微量試樣和增強劑均勻混合的需求。

混勻模塊通過固定于振動平板的微型直流電機帶動偏振子高速旋轉產生振蕩，振蕩經3根連接振動平板與樣品板的傳振立柱傳導，引發樣品槽內液體的快速波動，使原本上下分層的粘稠液滴快速融合吸附。如圖8所示，混勻后的液面平整，能避免人工混合造成的液面變化，有利于消除因激光斑點大小差異造成的拉曼散射信號強度變異。

混勻模塊整體設計為旋轉體，以滿足連續檢測的需求。振蕩的發生與消除在中空的旋轉體內部，振源部分采用懸浮式設計，利用壓縮彈簧將振動平板支持固定于旋轉體殼體上的沉頭孔內。考慮振動平板的大小以及傳振立柱的分布，上下各采用3根0.6 mm×11 mm×30 mm的不銹鋼壓縮彈簧，經試驗驗證可有效吸收激振，消除噪聲與殼體振動。振動平板、傳動立柱的材料選用聚甲醛(POM)材料，強度、剛度高，彈性好，質量輕。選用的5 V直流高速偏振電機作為振蕩源，體積小，易驅動，滿足樣品槽中微量液態試樣的混勻需求。電機導線通過旋轉體底部的空槽引出，并通過導電滑環連接外部電路，避免了因連續旋轉造成導線纏繞卡死，保證了設備的連續運行。

1.2.3控制模塊

控制模塊連接整個系統，并控制完成整個檢測過程，由計算機、單片機、步進電機驅動器、直流電機、直流電機驅動器、降壓板以及若干開關按鈕組成，如圖9所示。因SH-215B型高性能細分驅動器的供電電源為24 V直流電，選用了24 V直流電源適配器，并通過直流可調降壓穩壓板對5 V直流電機驅動器與單片機供電。STC89C52RC單片機編程簡單，價格便宜，單片機通過USB數據線與上位機進行串口通訊、控制按鈕功能以及驅動電機工作，從而實現了裝置的控制。

1.3 系統控制軟件

基于NI LabVIEW軟件開發工具，基于G語言編寫了上位機控制軟件，軟件圖形界面如圖10所示。上位機軟件可設定相關光譜采集和振動混勻時間參數，同時具備觸發采集、數據存儲和光譜顯示功能。上位機控制軟件和下位機自動混勻控制裝置的控制流程如圖11所示。上位機首先判斷下位機開關按鈕狀態，當開關按鈕閉合時，觸發上位機開始檢測按鈕，或者通過上位機軟件操作界面直接觸發開始檢測按鈕。開始檢測按鈕觸發后，上位機向單片機發送開始檢測信號，單片機接收信號后向步進電機驅動器發送脈沖，步進電機驅動器驅動步進電機旋轉進樣，同時轉換直流電機驅動器信號端口電平向直流電機供電混合樣品。達到設定振動混勻時間后，上位機向單片機發送指令，單片機控制直流電機驅動器信號引腳電平轉換，振動停止。當單片機完成發送指定的步進電機驅動脈沖數后，向上位機發送到位信號，上位機控制光譜采集系統獲取光譜信息，并實時顯示在上位機界面。完成設定積分次數后，上位機向單片機發送信號，單片機向步進電機驅動器發送指定數量的脈沖，驅動步進電機旋轉到下一個空樣品槽位置，等待下一次進樣。上位機完成光譜數據處理后，顯示預測值并復位開始檢測按鈕。

2 自動混勻控制拉曼光譜檢測系統試驗

2.1 試驗材料與方法

2.1.1試驗材料

于北京美廉美超市購買某品牌棗花蜂蜜，用于不同濃度獸藥殘留樣品的制備。硝基呋喃妥因(高效液相色譜大于98%)、磺胺甲氧噠嗪(高效液相色譜大于98%)購于上海源葉生物科技有限公司，用于獸藥拉曼特征位移的確定以及樣品的加標。

2.1.2試驗方法

樣品制備：利用硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪標準品分別配制質量比為20 mg/kg的硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪水溶液，將配制好的藥品溶液逐級稀釋并按照質量比1∶1與蜂蜜混合，分別制備硝基呋喃妥因、磺胺甲氧噠嗪質量比范圍在0～10 mg/kg的蜂蜜樣品各39個。

表面增強劑制備：根據Lee-Meisel經典方法[18]制備銀溶膠，置于4℃冰箱中避光保存備用。

光譜采集及預處理：實驗室自行搭建的拉曼點檢測裝置，設定曝光時間為1 s，激光功率為120 mW，手工操作采集蜂蜜樣品的表面增強拉曼光譜。然后將表面增強劑與試樣自動混勻控制裝置與拉曼點檢測裝置相連，設定振動混勻時間為7 s，保持同樣的曝光和激光功率，采集蜂蜜樣品的表面增強拉曼光譜。所獲光譜均利用Matlab R2016進行Savitzky-Golay(S-G)5點平滑和標準正態變量變換(SNV)預處理。

2.2 試驗結果與分析

2.2.1蜂蜜中兩種獸藥拉曼特征位移的歸屬

2.2.2兩種獸藥拉曼特征峰值穩定性比較分析

分別采集硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪質量比為2.5、5、7.5、10 mg/kg的蜂蜜樣品表面增強拉曼光譜，對比使用自動混勻控制裝置前后采集的獸藥拉曼特征峰值穩定性以驗證裝置使用效果。每個濃度的樣品分別重復試驗10次，采集的蜂蜜表面增強拉曼光譜均經過S-G與SNV預處理，其中硝基呋喃妥因預處理后的光譜曲線如圖14所示。經對比分析，自動混勻控制裝置使用前獸藥拉曼特征峰值強度在每個濃度分布離散，峰值強度與濃度的相關性較差，而使用自動混勻控制裝置后，采集的獸藥拉曼特征峰值強度和濃度之間具有明顯的正相關關系，且每個濃度所獲取的峰值強度分布集中，圖15為不同濃度的硝基呋喃妥因表面增強拉曼特征峰值強度箱線圖。另外，使用自動混勻控制裝置后，所獲硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪拉曼特征峰值在不同濃度下變異系數明顯優于僅使用拉曼點檢測裝置采集的結果，其中硝基呋喃妥因1 353 cm-1處的平均峰值變異系數降為0.032 2，1 612 cm-1處的平均峰值變異系數降為0.04；磺胺甲氧噠嗪833 cm-1處的平均峰值變異系數降為0.036 1，1 124 cm-1處的平均峰值變異系數降為0.064 9。其中，硝基呋喃妥因拉曼特征峰值強度變異系數統計結果如表1所示。結果表明使用自動混勻控制裝置顯著提高了采集光譜數據穩定性，減小了因人工操作造成的誤差，有利于后續蜂蜜中硝基呋喃妥因定量預測分析。

表1 蜂蜜中硝基呋喃妥因表面增強拉曼特征峰值強度變異系數Tab.1 Coefficients of variation of SERS characteristic peaks intensity of nitrofurantoin in honey

2.2.3蜂蜜中獸藥定量預測模型建立

表2 蜂蜜中獸藥殘留一元線性回歸模型的校正集和驗證集結果Tab.2 Calibration and prediction results of linear regression model of veterinary drug residues in honey

3 結論

(1)設計了表面增強劑與試樣自動混勻控制拉曼光譜檢測硬件系統，系統主要由拉曼光譜點檢測裝置、表面增強劑和微量液態樣品自動混勻控制裝置及數據處理部分組成。該系統保證每次檢測樣品與增強劑的均勻混合吸附條件的一致性，提高了表面增強拉曼光譜重復性。

(2)基于NI LabVIEW軟件開發工具，采用G語言編寫了實時控制分析軟件，實現了微量液態樣品和表面增強劑自動混勻進樣、光譜采集及數據處理等一鍵式操作，通過上位機與下位機均可一鍵完成檢測。

(3)通過試驗驗證了表面增強劑與試樣自動混勻控制拉曼光譜檢測系統的穩定性。通過對比發現，利用表面增強劑與試樣自動混勻控制拉曼檢測系統采集的硝基呋喃妥因拉曼特征平均峰值強度變異系數降為0.04以下，顯著提高了拉曼光譜穩定性。蜂蜜中硝基呋喃妥因和磺胺甲氧噠嗪兩種獸藥的最佳一元線性回歸模型驗證集決定系數分別為0.961 9與0.979 0，均方根誤差為0.672 3 mg/kg與0.518 6 mg/kg，說明自動混勻裝置在提高光譜穩定性的同時，能夠實現蜂蜜中獸藥殘留的定量預測。