酶法催化紫蘇油和MCT合成中長鏈甘油三酯研究

黃昭先 王滿意 孫承國 王風(fēng)艷 王翔宇 江連洲

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院， 北京 102209； 2.營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室， 北京 102209；3.中糧油脂專業(yè)化公司研發(fā)中心， 天津 300452； 4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030；5.臨邑禹王植物蛋白有限公司， 德州 253000)

0 引言

紫蘇油是從紫蘇中提取的一種植物油，富含α-亞麻酸(ALA，C18：3)[1]。紫蘇油中ALA含量最高，約占其總脂肪酸的60%[2]。ALA是ω-3多不飽和脂肪酸，是某些必需脂肪酸如二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)的代謝前體[3]。已證明，這些ω-3系列脂肪酸對人體健康具有生理益處，并且在預(yù)防和治療心血管疾病和炎癥性疾病中起到重要作用[4]。但是，紫蘇油是一種長鏈脂肪酸(LCFA，碳原子數(shù)超過14的脂肪酸)，其對應(yīng)的甘油三酯在血清中水解和清除速率相對較慢，不利于人體健康[5]。

中長鏈甘油三酯(MLCT)是一種功能性結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，在營養(yǎng)代謝方面優(yōu)于傳統(tǒng)的長鏈甘油三酯(LCT)和中鏈甘油三酯(MCT)。MLCT可以降低人體的血清甘油三酯和膽固醇含量，并抑制體內(nèi)脂肪的積累[6]。此外，MLCT還可以克服MCT的缺點，既可為人體提供必需的脂肪酸和能量供應(yīng)[7]，也可避免因體內(nèi)酮體過多而導(dǎo)致的中毒。MLCT可以通過酸解、酯化和酯交換等酶促方法進行制備[8-10]。酶促酯交換是生產(chǎn)結(jié)構(gòu)化脂質(zhì)(SLs)的一種優(yōu)選方法，酯交換產(chǎn)物中副產(chǎn)物含量低，且合成的產(chǎn)物得率較高。因此，結(jié)合脂肪酶催化的優(yōu)點和ALA的營養(yǎng)優(yōu)勢對MLCT進行合成具有重要意義。

近年來，均衡攝入脂肪酸受到廣泛關(guān)注，專業(yè)人士建議，每日需攝入一定量的ω-6和ω-3脂肪酸[11-12]。針對MLCT的研究主要使用富含ω-6或ω-9脂肪酸的植物油作為長鏈甘油三酯的來源[13-15]。ω-3脂肪酸的食物來源有限，某些海洋魚油富含ω-3脂肪酸，但其氧化穩(wěn)定性較差，并且從長遠(yuǎn)來看，海洋資源的使用不可持續(xù)[16]。紫蘇油是ω-3脂肪酸含量最高的植物油，成為合成MLCT的優(yōu)質(zhì)來源。

本文通過Lipozyme RM IM催化紫蘇油與MCT進行酯交換合成富含α-亞麻酸的中長鏈甘油三酯(MLCT)，研究酶添加量、底物中MCT濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對MLCT得率的影響，采用兩步法除臭去除游離脂肪酸(FFA)、甘油二酯(DAG)和甘油一酯(MAG)等副產(chǎn)物，以避免反式脂肪酸的大量形成，為多不飽和油的物理脫酸提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇油、活性白土，中糧東海糧油工業(yè)(張家港)有限公司；MCT，印度尼西亞Musim Mas公司；Lipozyme RM IM(來自Rhizomucormiehei的脂肪酶，275 IUN/g)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的標(biāo)準(zhǔn)混合物、豬胰脂酶(100～400 U/mg)、脂肪酸甲酯，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；乙酸、正己烷和異丙醇均為色譜級，上海阿拉丁有限公司；硅膠GF預(yù)涂板(10 cm×20 cm)，上海國藥控股化學(xué)試劑有限公司；其他試劑和溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2014C型氣相色譜儀，日本島津有限公司；7890A型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；1260 Infinity型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Ace-2L型(定制)精煉小試裝置，美國ACE公司；PL2002型電子天平、AL204-IC型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1酯交換反應(yīng)

紫蘇油和MCT的酯交換反應(yīng)在無溶劑體系中進行。將150 g紫蘇油和MCT置于250 mL燒瓶中，使用機械攪拌器以200 r/min攪拌混合。在一定溫度下添加脂肪酶并開始計時，反應(yīng)一段時間。反應(yīng)結(jié)束后過濾除去酶，所有產(chǎn)物均存儲在-20℃等待分析。

1.3.2薄層色譜(TLC)分離甘油三酯

將10 μL油樣品溶于10 μL正己烷中，在距TLC板底部2 cm水平線上點樣，將TLC板底部浸入由正己烷/叔丁基甲基甲醚/乙酸(體積比40∶10∶1)組成的溶劑體系120 min。隨后取出TLC板并干燥，將2，7-二氯熒光素乙醇溶液(2 g/L)噴霧到TLC板上，在紫外燈下觀察分離情況。刮下對應(yīng)的甘油三酯(TAG)區(qū)域，然后用正己烷萃取得到甘油三酯。

1.3.3甘油三酯中MLCT的得率

通過氣相色譜法測定甘油三酯中MLCT的得率。氣相色譜條件如下：DB-1型毛細(xì)管柱(15.0 m×0.53 mm×0.15 μm，美國安捷倫公司)，F(xiàn)ID(氫離子火焰化)檢測器，進樣量5 μL，高純氫氣作為載氣，入口溫度350℃，檢測器溫度380℃，非分流模式，氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，補充氣流速25 mL/min。柱溫箱程序如下：初始溫度200℃，以10℃/min的速度升至300℃，保持2 min；以3℃/min的速度升至330℃。酯交換后的甘油三酯包含以下構(gòu)型：MMM、MLM、LMM、LLM、LML和LLL。其中，MLM、LMM、LLM和LML稱為MLCT。甘油三酯上脂肪酸的總碳數(shù)(TCN)由氣相色譜確定，MMM的TCN為24～30，MLM和LMM(稱為2M1L)為32～38，LLM和LML(稱為1M2L)為40～46，LLL為48～54。MLCT得率計算公式為

式中AMMM——MMM質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

AMLM——MLM質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

AMML——MML質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

ALLM——LLM質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

ALML——LML質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

ALLL——LLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%

1.3.4精煉

脫色：取一定量的酯交換油進行脫色處理，真空條件下(真空度小于0.533 kPa)，將酯交換油加熱至90℃，加入一定量的活性白土，加熱至100℃，200 r/min攪拌30 min，抽濾除去活性白土，得到脫色油。

脫臭：將一定量脫色油加入到定制脫臭裝置中，抽真空，保持整套設(shè)備內(nèi)部真空度小于0.4 kPa，除臭溫度和時間參數(shù)有3種：兩步法，首先在200℃下保持40 min，然后加熱到240℃并保持20 min；低溫法：在200℃保持60 min； 高溫法，在240℃保持60 min。脫臭后，除臭系統(tǒng)迅速冷卻至100℃以下。脫臭過程中的水蒸氣由儲水管中的水在設(shè)備的真空條件氣化形成，通入油樣中翻滾沸騰，并在真空的條件下被帶出，在-40℃冷肼中迅速冷凍。

1.3.5脂肪酸組成和sn-2脂肪酸分析

油樣首先作甲酯化處理，將1.5 mL氫氧化鉀甲醇溶液(0.5 mol/L)加到樣品中，在70℃下混合5 min，加入2 mL三氟化硼甲醇溶液(體積分?jǐn)?shù)14%)并振搖3 min，然后加入1 mL正己烷和1 mL飽和氯化鈉溶液，以提取脂肪酸甲酯，取上層清液進樣。氣相色譜條件：Agilent HP-88型毛細(xì)管柱(100 m×250 μm×0.25 μm)，進樣口溫度250℃；檢測器溫度280℃；載氣：高純度氫氣；分流比50∶1；進樣2.0 μL。柱溫箱程序：初始溫度45℃，保持4 min，以13℃/min升至175℃，保持27 min，以4℃/min升至215℃，保持35 min。

利用豬胰脂酶將酰基甘油催化生成sn-2甘油一酯。主要步驟如下：將10 mg樣品、7 mL的Tris-HCl緩沖液(1 mol/L，pH值8.0)、2 mL膽酸鈉溶液(0.5 g/L)、1 mL的CaCl2(22 g/L)和50 mg胰脂酶在40℃下渦旋混合3 min，加入1 mL的HCl溶液(6 mol/L)和2 mL乙醚，渦旋混合1 min，在4 000 r/min下離心10 min。收集上層液并將其均勻涂于TLC板底部上方2 cm的水平線上。分離sn-2甘油一酯的TLC方法與上述方法相同。刮下sn-2甘油一酯條帶，用正己烷萃取后進行脂肪酸組成分析。

1.3.6甘油酯成分分析

通過HPLC-ELSD(高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器)對甘油酯成分進行定量分析。將樣品溶解于正己烷中稀釋至10 mg/mL，進樣。色譜條件：Zorbax RX-Sil型色譜柱(5 μm×4.6 mm×250 mm)；柱溫35℃；ELSD漂移管溫度70℃；霧化氣體：高純氮氣；載氣壓力0.21 MPa；增益1倍；進樣量1.5 μL；流動相：A為正己烷/異丙醇(體積比99∶1)，B為正己烷/異丙醇/乙酸(體積比100∶100∶1)；流動相洗脫梯度：100%A(0 min)-80%A(10 min)-70%A(14 min)-100%A(20 min)-100%A(25 min)。甘油三酯、游離脂肪酸、1,3-甘油二酯、1,2-甘油二酯、甘油一酯的保留時間分別為3.9、5.3、6.2、7.6、14.9 min。根據(jù)濃度和峰面積制定標(biāo)準(zhǔn)曲線以供使用。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

每個實驗均進行3次重復(fù)平行實驗，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行ANOVA差異顯著性分析，以p<0.05為顯著性差異。采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酯交換條件對反應(yīng)產(chǎn)物的影響

2.1.1酶添加量

將不同添加量的脂肪酶(2%、4%、6%、8%、10%、12%)加入到MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的反應(yīng)底物中，在50℃下反應(yīng)4 h。如圖1a所示，MLCT得率隨著酶添加量的增加而逐漸增加，反應(yīng)得率在61%～76%之間，當(dāng)酶添加量超過6%時，MLCT得率的增加變慢，這可能是由于過量的酶導(dǎo)致酶聚集和底物的擴散，從而抑制了酶的活性[17]。MLCT所含的1M2L(1中鏈，2長鏈甘油三酯)和2M1L(2中鏈，1長鏈甘油三酯)的趨勢與MLCT相似。盡管較高的酶添加量有助于提高反應(yīng)速率，但也使反應(yīng)的成本增加[18-19]。由圖1b可知，隨著酶添加量的增加，甘油一酯(MAG)、甘油二酯(DAG)和游離脂肪酸(FFA)等反應(yīng)副產(chǎn)物也有所增加，它將影響產(chǎn)品的最終得率和后續(xù)加工。ALA總含量隨著脂肪酶含量的增加而降低，而sn-2中的ALA含量則升高。酶添加量增加會促進酯交換反應(yīng)，將更多的中鏈脂肪酸(MCFA)引入TAG[20]，導(dǎo)致ALA含量降低。這可能與在脂肪酶催化的酯化過程中發(fā)生的酰基遷移有關(guān)[21]。ALA酰基從sn-1或sn-3遷移至sn-2，導(dǎo)致反應(yīng)朝著MLM型或MLL型MLCT進行。有研究表明長鏈脂肪酸位于sn-2時MLCT被人體吸收的效率更高[22]。

2.1.2底物中MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)

以6%脂肪酶催化底物在50℃下反應(yīng)4 h，MCT在底物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%和70%。結(jié)果如圖2a所示，MCT在底物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于40%，MLCT得率隨MCT濃度的增加而增加，當(dāng)MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過40%時MLCT得率下降，1M2L和2M1L的產(chǎn)量也具有先升后降的趨勢，類似于MLCT，但是1M2L得率在MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%時達到最大，2M1L得率在MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%時達到最大。因此，MCT的濃度不僅影響MLCT的得率，而且還影響MLCT中1M2L和2M1L的不同比例，過量的MCT更有可能形成2M1L，而過量的LCT更可能形成1M2L。MCT的濃度對副產(chǎn)物沒有明顯的影響，隨著MCT濃度的增加，紫蘇油在底物中的相對含量降低，ALA含量降低(圖2b)。

2.1.3反應(yīng)溫度

以6%脂肪酶催化MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的底物，在不同溫度(30、40、50、60、70、80、90℃)下反應(yīng)4 h。結(jié)果如圖3a所示，MLCT的得率隨著溫度升高而提高，在60℃以后得率提升不明顯，但是由圖3b可知，TAG得率增加，副產(chǎn)物減少。一般認(rèn)為，隨著溫度升高到一定程度，脂肪酶的活性受到抑制[23]，但是本實驗中Lipozyme RM IM可以耐受高溫，并在一個較廣的溫度范圍內(nèi)保持活性。隨著溫度的升高，ALA的總含量先升高后降低，而sn-2上的ALA含量升高(圖3b)。

2.1.4反應(yīng)時間

以6%脂肪酶催化MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的底物，在50℃下反應(yīng)不同時間(0.5、1、2、4、6、8、10、12、14 h)。由圖4a可知，隨著反應(yīng)的進行，MLCT的得率提高，并在4 h達到平衡，1M2L和2M1L得率的變化與MLCT的變化相似。如圖4b所示，副產(chǎn)物隨著反應(yīng)時間的增加而增加，這將導(dǎo)致產(chǎn)物質(zhì)量下降和精煉成本增加。延長反應(yīng)時間有助于酯交換反應(yīng)達到平衡，將中鏈脂肪酸引入TAG，但也可能會因為酰基遷移而降低了ALA總含量并增加了sn-2 ALA含量。

2.2 酯交換油脂精煉

2.2.1甘油酯和脂肪酸含量的變化

在酶促酯交換過程中會產(chǎn)生許多副產(chǎn)物，例如FFA、DAG和MAG[20]。因此，本研究中減小副產(chǎn)物尤其是游離脂肪酸也是一項重要的目標(biāo)。酯交換條件如下：酶添加量6%，底物中MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間4 h。酯交換油脂后的結(jié)果如圖5(圖中同種物質(zhì)不同字母表示差異顯著)所示，其中TAG顯著降低至92.00%，DAG、MAG和FFA含量顯著增加，其中FFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.29%；酯交換油脂經(jīng)過精煉、兩步法除臭、低溫脫臭和高溫脫臭后TAG含量顯著增加，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.31%、96.94%和98.47%；MAG和FFA含量顯著下降，低溫除臭后的FFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.44%，遠(yuǎn)高于兩步法脫臭和高溫除臭，這表明低溫不能有效去除游離脂肪酸。此外，精煉油中還含有大量的多不飽和脂肪酸，如亞油酸和亞麻酸，它們不穩(wěn)定并可能會在高溫下轉(zhuǎn)化為反式脂肪酸(TFA)[24]。由圖5可知，高溫脫臭促進了TFA的形成，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.27%，顯著高于兩步法脫臭(0.93%)和低溫除臭(0.56%)。在兩步法除臭過程中，第1步(200℃，40 min)除去沸點較低的FFA，例如MCFA，第2步(240℃，20 min)除去沸點較高的長鏈脂肪酸，如亞油酸和亞麻酸。由于在高溫下該過程的持續(xù)時間短，TFA的形成有限。兩步法脫臭結(jié)合了高溫除臭和低溫除臭的優(yōu)點，它不僅可以去除FFA，而且可以限制TFA的產(chǎn)生。另外，與化學(xué)法脫酸相比，兩步法物理脫臭可以純化酯交換產(chǎn)物并減少中性油的損失[25]，并且比使用85%乙醇作為萃取溶劑的陰離子交換樹脂純化方法更加高效[26]。

2.2.2精煉產(chǎn)品中的脂肪酸組成

在脂肪酶的催化下，MCT中的辛酸和癸酸，紫蘇油中的油酸、亞油酸、亞麻酸和其他長鏈脂肪酸參與酯交換反應(yīng)，這些脂肪酸在甘油酯中的位置將會重新排列。精煉可以部分除去反應(yīng)過程中形成的FFA、MAG和DAG，因此精煉產(chǎn)品中的脂肪酸組成會發(fā)生變化。與物理混合物相比，酯交換油脂精煉產(chǎn)品的LCFA和亞麻酸含量顯著增加，α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達44.88%，MCFA含量顯著降低(表1)。同時，在sn-2位置，LCFA和亞麻酸含量明顯增加，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為88.8%和59.72%，MCFA含量明顯減少。精煉產(chǎn)品中MLCT大部分為LLM、MLL和MLM，而少數(shù)為LML、LMM和MML。據(jù)報道，MCFA在sn-1,3位置、LCFA在sn-2位置的甘油三酯可以提高LCFA的吸收率，改善吸收不良的情況[27]。

2.2.3甘油三酯組成的變化

酯交換作用發(fā)生的變化主要體現(xiàn)在甘油三酯組成上的變化。如圖6和表2所示，反應(yīng)后MCT和LCT顯著減少，形成MLCT(包括2M1L和1M2L)。在60℃下，MCT質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的底物在6%的酶催化下反應(yīng)4 h，達到反應(yīng)平衡后，甘油三酯中MLCT的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.95%。

表1 紫蘇油、MCT、物理混合油和酯交換油的脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Fatty acids composition of perilla oil, MCT, physical blend and purified products %

表2 紫蘇油、MCT、物理混合油和酯交換油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和甘油三酯碳數(shù)組成Tab.2 Triacylglycerols composition of perilla oil, MCT, physical blend and purified products

3 結(jié)束語

40%MCT和60%紫蘇油在6%的Lipozyme RM IM催化作用下，于60℃進行了4 h的酯交換反應(yīng)，結(jié)果顯示甘油三酯中MLCT的得率高于70%。采用兩步法脫臭純化酯交換反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果表明，去除游離脂肪酸的效果明顯，在純化產(chǎn)物中甘油三酯可以達到97%，并且反式脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在1%以內(nèi)，α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于40%，sn-2位置上85%為長鏈脂肪酸。