稀有人參皂苷Rg5的高效制備方法

張仔豪，葉安琪，成樂琴

吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院（吉林 132022）

人參為五加科多年生草本植物，在我國有數(shù)千年的藥用歷史，具有抗腫瘤、抗衰老、抗心律失常、抑制細(xì)胞凋亡、降糖降脂、改善學(xué)習(xí)記憶、增強(qiáng)性功能和免疫功能等方面的作用[1-4]，廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域、保健食品和功能食品[5-9]。人參含有人參皂苷、人參多糖、揮發(fā)油（萜類、醇類、脂肪酸類等）和氨基酸等化學(xué)成分[10]，其中人參皂苷被視為人參最重要的標(biāo)志性成分[11]。人參皂苷是一種固醇類糖苷化合物，一定條件下通過糖苷鍵的修飾可以轉(zhuǎn)化成為次級稀有人參皂苷。大量研究表明，次級人參皂苷比未經(jīng)修飾的人參皂苷顯示出更好的吸收和藥理活性。例如人參皂苷Rg3顯示出抑制肺癌細(xì)胞增值作用[12]、Rh2顯示出抑制前列腺癌細(xì)胞PC3增殖作用[13]、C-K顯示出抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲作用[14]等。

人參皂苷Rg5是比人參皂苷Rg3少1分子水的次級稀有人參皂苷，現(xiàn)代藥理研究表明人參皂苷Rg5對抑制慢性皮炎[15]、改善肺部炎癥[16]、抗乳腺癌[17]、促進(jìn)血管生成和血管舒張[18]等方面具有良好的作用。從人參皂苷Rg3和Rg5的對比研究可見，人參皂苷Rg5在改善記憶[19]、抗癌作用（宮頸癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌）、益智作用[20-22]和抗氧化方面的作用[23]均優(yōu)于人參皂苷Rg3，并且具有與后者類似的免疫提高作用[24]。相比人參皂苷Rg3已經(jīng)成功開發(fā)成為一類抗癌藥物“參一膠囊”相比，人參皂苷Rg5的研究還非常滯后，因此有必要對人參皂苷Rg5的高效制備進(jìn)行深入研究。

原人參二醇組皂苷（簡稱PPD型人參皂苷）經(jīng)不同糖苷鍵的結(jié)構(gòu)修飾，可以得到眾多結(jié)構(gòu)不相同的次級人參皂苷（見圖1）。Rg5是PPD型人參皂苷的眾多結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物中的一種，顯然，如何通過提高人參皂苷Rg5的選擇性和穩(wěn)定性來提高人參皂苷Rg5收率是非常值得探究的問題。目前PPD皂苷經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾制備人參皂苷Rg5往往采用水溶劑和有機(jī)弱酸[25-26]，不僅原料處理量少、而且生成大量的人參皂苷Rg3導(dǎo)致收率普遍較低。以PPD型皂苷為原料，以無機(jī)強(qiáng)酸鹽酸為催化劑，95%乙醇為溶劑，以原料轉(zhuǎn)化率和人參皂苷Rg5的收率為考察指標(biāo)，研究人參皂苷Rg5的制備方法，并通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化制備條件，探索一條高效方便地制備人參皂苷Rg5的工藝條件。

圖1 PPD型人參皂苷的結(jié)構(gòu)修飾次級皂苷結(jié)構(gòu)式

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DK-98-Ⅱ型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司RE-52C；P2303型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；反向色譜柱PinnacleⅡ C18（250 mm×4.60 mm，5 μm），Restek U.S。

P P D 皂苷，自制；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品R b1（純度≥98%）、Rb2（純度≥98%）、Rb3（純度≥ 98%）、Rc（純度≥98%）、Rd（純度≥98%）、Rg5（純度≥98%），成都曼斯特公司；乙腈（色譜純），瑞典歐森巴克化學(xué)公司；甲醇（色譜純），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純）、乙醇（分析純）等，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原人參二醇組皂苷的分離

向處理好的D101C大孔吸附樹脂中加入15 mg/mL的人參根總皂苷溶液，于60 ℃靜態(tài)吸附12 h。再將已吸附有人參皂苷的D101C大孔吸附樹脂用蒸餾水反復(fù)洗滌，依次使用35%和80%乙醇水溶液于25 ℃下靜態(tài)解吸12 h，將80%乙醇解析液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，所得殘留物用適量的70%乙醇溶解，磁力攪拌下緩慢加入丙酮，經(jīng)過濾、干燥得PPD皂苷原料。

1.2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化

取5個編號為1～5的小玻璃瓶，分別加入100 μL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的PPD皂苷的95%乙醇溶液，并加入一定濃度的95%乙醇鹽酸溶液，水浴加熱數(shù)小時。反應(yīng)結(jié)束，加入適量的飽和碳酸鈉溶液至pH 6.0左右，在45 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘留物中加入6 mL色譜純甲醇溶解，用0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，分別計(jì)算原料中各單體皂苷的轉(zhuǎn)化率和人參皂苷Rg5的收率。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時間（B）、酸量（C）為考察因素，根據(jù)L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。因素水平表如表1。

表1 因素水平表

1.2.4 HPLC分析方法

試驗(yàn)中采用的色譜條件為：色譜柱PinnacleⅡC18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流速，1.0 mL/min；檢測波長，203 nm；柱溫，35 ℃；進(jìn)樣量，20 μL；流動相A，乙腈；流動相B，純凈水（超聲除氣處理）。梯度洗脫程序：0.00～10.00 min，A 22%；10.00～20.00 min，A 22%～27%；20.00～25.00 min，A 27%～31%；25.00～45.00 min，A 31%～38%；45.00～60.00 min，A 38%～52%；60.00～65.00 min，A 52%；65.00～75.00 min，A 52%～55%；75.00～77.00 min，A 55%～60%；77.00～77.10 min，A 60%～90%；77.10～97.00 min，A 90%；97.00～97.10 min，A 90%～22%；97.10～110.00 min，A 22%。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 PPD皂苷的制備

人參根總皂苷通過D101C大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附與靜態(tài)解吸，并結(jié)合丙酮沉淀法沉淀，分離得到PPD原料，經(jīng)HPLC定量分析結(jié)果表明，PPD皂苷含量為92.33%，其中單體人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd的含量分別為46.55%，13.43%，17.42%，4.26%和10.66%。HPLC分析見圖2。

圖2 原人參二醇組皂苷PPD液相色譜圖

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化人參皂苷Rg5的制備方法

2.2.1 鹽酸濃度對制備人參皂苷Rg5的影響

在質(zhì)量濃度為20 mg/mL的PPD型人參皂苷溶液（溶劑為95%的乙醇）中，依次加入等體積的用95%乙醇配制的0.01～0.05 mol/L濃度的鹽酸溶液，在70 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC定量分析結(jié)果見圖3。

圖3 酸濃度對原料的轉(zhuǎn)化率和人參皂苷Rg5收率的影響

從原料中各種單體人參皂苷的轉(zhuǎn)化率來看，當(dāng)酸濃度為0.01 mol/L時，除了人參皂苷Rc和Rb3全部參與反應(yīng)以外，人參皂苷Rb1、Rb2、Rd均有剩余。HPLC定量分析結(jié)果表明，在該反應(yīng)條件下人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化率為86.61%，而Rb2和Rd的轉(zhuǎn)化率分別為90.81%和80.71%，表明這3種皂苷還有約10～20%沒有參加反應(yīng)；酸濃度進(jìn)一步增加到0.02 mol/L或以上時，原料中所有單體皂苷的轉(zhuǎn)化率全部可以達(dá)到100%。從酸濃度對人參皂苷Rg5的收率影響來看，酸濃度為0.01 mol/L時Rg5的收率最高可達(dá)到48.91%，而隨著酸濃度的進(jìn)一步增加，Rg5的收率逐漸下降，說明酸濃度的提高一方面可以提高原料的轉(zhuǎn)化率，另一方面還會促進(jìn)人參皂苷Rg5的進(jìn)一步分解。因此結(jié)合人參皂苷Rg5的收率和原料的轉(zhuǎn)化率，選擇0.01 mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行了進(jìn)一步的工藝條件優(yōu)化。

2.2.2 鹽酸用量對制備人參皂苷Rg5的影響

在100 μL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的PPD型人參皂苷溶液（溶劑為95%的乙醇）中，依次加入50～150 μL的用95%乙醇配制的0.01 mol/L濃度的鹽酸溶液，在70 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC定量分析結(jié)果見圖4。

由圖4可見，酸量對反應(yīng)的影響非常顯著。當(dāng)酸量為50 μL時，原料中所有的皂苷都有大量的剩余，但隨著酸量的增加，人參皂苷Rc，Rb3，Rb2，Rd和Rb1的轉(zhuǎn)化率依次達(dá)到100%，而且當(dāng)酸量為150 μL時，原料中所有皂苷的轉(zhuǎn)化率均可達(dá)到100%。而酸量對人參皂苷Rg5收率的影響顯示，酸量在50～125 μL范圍內(nèi)，人參皂苷Rg5的收率隨酸量的增加而升高，而進(jìn)一步增加酸量時，Rg5的收率有所下降，即顯示出先增后降趨勢。

圖4 酸量對原料的轉(zhuǎn)化率和人參皂苷Rg5收率的影響

2.2.3 反應(yīng)溫度對制備人參皂苷Rg5的影響

在100 μL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的PPD型人參皂苷溶液（溶劑為95%的乙醇）中，依次加入125 μL的用95%乙醇配制的0.01 mol/L濃度的鹽酸溶液，分別在60～80 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC定量分析結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時，只有含量極低的Rb3的轉(zhuǎn)化率為100%以外，其它單體皂苷的轉(zhuǎn)化率基本在65%～80%之間，但隨著反應(yīng)溫度的升高，轉(zhuǎn)化率逐漸提高，而且人參皂苷Rc，Rb2，Rd和Rb1的順序依次達(dá)到100%的轉(zhuǎn)化率，并在75 ℃反應(yīng)溫度下所有皂苷的轉(zhuǎn)化率均達(dá)到100%。反應(yīng)溫度對人參皂苷Rg5的收率影響方面，剛開始，隨反應(yīng)溫度的升高而升高，而且溫度到70 ℃時收率達(dá)到最高值51.68%。如果反應(yīng)溫度繼續(xù)升高，雖然可以加快原料的轉(zhuǎn)化速度，但是因人參皂苷Rg5的分解加快，導(dǎo)致收率反而快速下降，因此選擇70 ℃進(jìn)行了進(jìn)一步的條件優(yōu)化。

圖5 反應(yīng)溫度對原料的轉(zhuǎn)化率和人參皂苷Rg5收率的影響

2.2.4 反應(yīng)時間對制備人參皂苷Rg5的影響

在100 μL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的PPD型人參皂苷溶液（溶劑為95%的乙醇）中，依次加入125 μL的用95%乙醇配制的0.01 mol/L濃度的鹽酸溶液，在70 ℃反應(yīng)2.5～4.5 h。反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC定量分析結(jié)果見圖6。

圖6表明，原料中人參皂苷Rc、Rb2、Rb3和Rd在反應(yīng)2.5 h時就可以達(dá)到100%的轉(zhuǎn)化率（Rb1為89.34%），而含量最高的人參皂苷Rb1在反應(yīng)3.5 h時達(dá)到100%的轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)時間對人參皂苷Rg5的影響如同反應(yīng)溫度，也是先增后降。在反應(yīng)2.5～3 h內(nèi)，Rg5的收率增加，而進(jìn)一步延長反應(yīng)時間時，原料轉(zhuǎn)化生成Rg5的反應(yīng)變少，而更多的是次級皂苷Rg5的進(jìn)一步降解反應(yīng)，即Rg5的分解量大于Rg5的生成量，因此Rg5的收率逐漸下降。

圖6 反應(yīng)時間對原料的轉(zhuǎn)化率和人參皂苷Rg5收率的影響

2.3 正交試驗(yàn)對制備人參皂苷Rg5的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時間（B）和酸量（C）為考察因素，根據(jù)L9(34)正交表進(jìn)一步優(yōu)化了人參皂苷Rg5的制備工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析結(jié)果見表2。

由表2的極差分析可知，影響Rg5收率的因素主次順序?yàn)锳＞C＞B，即反應(yīng)溫度的影響大于酸量、大于反應(yīng)時間；最優(yōu)方案為A2B1C2，即反應(yīng)溫度為70 ℃，反應(yīng)時間為3 h，酸量為125 μL，此時對產(chǎn)物的HPLC定量分析（見圖7）結(jié)果表明，人參皂苷Rg5的收率可以達(dá)到52.32%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于通過人參皂苷制備人參皂苷Rg5的已報道的文獻(xiàn)水平[25-26]。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

圖7 最優(yōu)方案液相色譜譜圖

3 結(jié)論與討論

綜上分析可知，以鹽酸為催化劑，95%的乙醇為溶劑，制備人參皂苷Rg5的優(yōu)化條件為PPD皂苷質(zhì)量濃度為20 mg/mL、鹽酸濃度0.01 mol/L、酸量為125 μL、反應(yīng)溫度為70 ℃、反應(yīng)時間3 h，此時PPD皂苷中Rb1的轉(zhuǎn)化率為88.84%，Rc轉(zhuǎn)化率為100%，Rb2轉(zhuǎn)化率為100%，Rb3轉(zhuǎn)化率為100%，Rd轉(zhuǎn)化率為100%，Rg5的收率為52.32%。

人參皂苷Rg5的收率主要取決于原料的轉(zhuǎn)化率、人參皂苷中糖苷鍵的修飾位置即選擇性（見圖1）以及人參皂苷Rg5的分解情況。一般來說，原料轉(zhuǎn)化率和對糖苷鍵修飾選擇性越高、Rg5的分解越少，Rg5的收率就越高。研究選擇無機(jī)強(qiáng)酸作催化劑，提高了原料的處理量和轉(zhuǎn)化率；采用乙醇作溶劑，提高了人參皂苷發(fā)生消除反應(yīng)生成Rg5的選擇性；通過優(yōu)化制備條件，減少了人參皂苷Rg5的分解，從而有效提高了人參皂苷Rg5的收率。方法與Huang等[27]所報道的酒石酸催化制備人參皂苷Rg3、Rg5相比，一方面，原料PPD皂苷質(zhì)量濃度由1 mg/mL提高到了20 mg/mL，即原料處理量提高到了20倍，而酸濃度由有機(jī)酸的0.8～ 1.5 mol/L降低到了0.01 mol/L，顯著提高了制備效率，而且降低了成本；另一方面，孫成鵬[25]和楊凌[26]研究相比，提高了反應(yīng)選擇性，使人參皂苷Rg5的收率由30.77%和14.7%提高到52%以上。由此可見，方法操作簡單，收率和制備效率高，適合實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)，這對于研究人參皂苷Rg5的制備及其藥理活性具有重要參考價值。