響應(yīng)面優(yōu)化花生芽中白藜蘆醇提取工藝

武鵬程，蒲云峰，張斌，張金榮，王麗玲，王強(qiáng)

塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（阿拉爾 843300）

花生（Arachis hypogaeaL.）是薔薇目、豆科、落花生屬的一年生草本植物，在亞洲、非洲和美洲等國(guó)家均有種植，我國(guó)新疆花生的種植已有100多年的歷史，因地處內(nèi)陸腹地，具有典型的溫帶大陸性氣候，氣候干燥，降雨量少，種植花生具有不易滋生黃曲霉毒素的綠色優(yōu)勢(shì)[1]。花生營(yíng)養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量約為25.8%，脂質(zhì)含量為49.2%，碳水化合物含量為16.1%，水分含量為6.5%，灰分含量為2.3%。此外，花生還富含維生素C[2]、白藜蘆醇（Resveratrol，Res）等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，花生萌芽后蛋白質(zhì)逐漸降解為肽和氨基酸，其生物利用率顯著提高，脂肪含量顯著降低，維生素含量全面提高，營(yíng)養(yǎng)因子得到改善，特別是具有重要生理功能的多酚類物質(zhì)Res含量迅速增加[4]。

白藜蘆醇（Res）是一類天然非黃酮類多酚，廣泛存在于虎杖、花生、葡萄、桑葚等植物中[5]，是植物在受到誘導(dǎo)脅迫時(shí)自發(fā)啟動(dòng)防御機(jī)制而大量產(chǎn)生的一種植物抗毒素[6]。Res無(wú)色、無(wú)味，難溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，學(xué)名為3, 4, 5-三羥基二苯乙烯，分子式為C14H12O3，自然界中Res主要以順式Res苷和反式Res苷兩種形式存在[7]，具有抗癌、抗過(guò)敏、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)油脂代謝、保護(hù)心血管等多種生理活性功能[8-9]。以Res為主要成分的保健品，在美國(guó)、日本、加拿大等國(guó)家早已廣泛被消費(fèi)者接受；在我國(guó)，近年來(lái)隨著研究者不斷的深入研究和推廣，Res相關(guān)產(chǎn)品也在逐漸被人們接受，呈現(xiàn)潛在良好的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益[10]。

此次試驗(yàn)以新疆阿拉爾花生為原料，經(jīng)發(fā)芽后使用超聲波輔助纖維素酶法提取Res，以期為Res的提取提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

花生芽：取顆粒飽滿，大小相等完整的花生，整齊、等距擺放在已滅菌的塑料育苗托盤(pán)上，將培育盤(pán)壓水盤(pán)依次裝入豆芽機(jī)中，避光，透氣，在25～30 ℃條件下培養(yǎng)50 h，期間每隔1 h澆1次水，每隔4 h換1次水，將發(fā)芽后的花生（長(zhǎng)約15 cm）洗凈，瀝干，于50 ℃烘24 h，粉碎，備用。

Res標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇、甲醇（分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司）；纖維素酶（山東西亞化學(xué)股份有限公司）。

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；JP-060S型數(shù)控超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；SHA-B型水浴恒溫振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DYJ-2016豆芽機(jī)（中山市德容電子科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Res的測(cè)定

色譜柱，ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇；流動(dòng)相B為0.5%甲酸；流速0.7 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)305 nm。

1.2.2 Res標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取5 mg Res標(biāo)準(zhǔn)品，用50 mL甲醇溶解并定容成100 μg/mL的儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液進(jìn)行一定梯度的稀釋，配制成0.2，1，2，5，10，20，40和80 μg/mL的對(duì)照液。

將制備的對(duì)照液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后上高效液相色譜，測(cè)定其峰面積，得線性方程：Y=122 979X-128 545（R2=0.998 4）。式中，X為質(zhì)量濃度；Y為不同濃度下的相應(yīng)峰面積。結(jié)果顯示，此曲線在一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，適合用于Res的測(cè)定。

1.2.3 Res的提取

以料液比、超聲溫度、時(shí)間和酶添加量4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，精確稱取1.000 g備用花生芽粉，加入一定量的70%乙醇和纖維素酶，振蕩混勻，在超聲提取儀中調(diào)節(jié)不同溫度提取一定時(shí)間，取濾液離心，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，然后上高效液相色譜儀測(cè)定其含量，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。由線性回歸線性方程得出Res濃度。式（1）計(jì)算Res提取率。

Res提取率（mg/g）=C×V/M×稀釋倍數(shù) （1）

式中：M為花生芽粉的質(zhì)量，g；V為提取液稀釋后的體積，mL；C為測(cè)定的樣液中Res質(zhì)量濃度，μg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)花生芽中Res提取率的影響

準(zhǔn)確稱取適量花生芽粉，纖維素酶添加量為8 mg/g，提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），在50 ℃的條件下酶解1.5 h，經(jīng)40 kHz超聲波處理30 min，分析料液比對(duì)Res提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

隨著料液比的增加，Res提取率增加，當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，提取率達(dá)到最大；料液比超過(guò)1∶40（g/mL）后，Res提取率略有下降，這是由于當(dāng)溶質(zhì)的量一定時(shí)，增加溶劑的量有利于原料中有效成分向浸提液中擴(kuò)散，提高Res的浸出率，但繼續(xù)增加浸提溶劑，原料中的有效成分會(huì)被稀釋。綜合考慮提取率和經(jīng)濟(jì)效益的影響，選擇料液比1∶40（g/mL）為宜。

圖1 料液比對(duì)花生芽中Res提取率的影響

2.1.2 超聲波溫度對(duì)花生芽中Res提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份1.000 g花生芽粉，纖維素酶添加量為8 mg/g，提取溶劑為70%乙醇，在料液比1∶40（g/mL）的條件下酶解1.5 h，分別經(jīng)30，40，50，60和70 ℃的40 kHz超聲波處理30 min，分析超聲波溫度對(duì)Res提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

隨著超聲波處理溫度的提高，Res提取率增加，當(dāng)超聲波處理溫度為50 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大；超聲波處理溫度超過(guò)50 ℃后，Res提取率下降，這是由于根據(jù)布朗運(yùn)動(dòng)原理，溫度升高，組織內(nèi)的分子運(yùn)動(dòng)加劇，擴(kuò)散和滲透速度加快，溶出的Res增加，但繼續(xù)提高超聲波處理溫度，會(huì)導(dǎo)致熱敏性Res喪失生理活性。因此，提取溫度選擇50 ℃最佳。

圖2 超聲波溫度對(duì)花生芽中Res提取率的影響

2.1.3 超聲波時(shí)間對(duì)花生芽中Res提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份1.000 g花生芽粉，纖維素酶添加量為8 mg/g，提取溶劑為70%乙醇，在料液比1∶40（g/mL）的條件下酶解1.5 h，置于50 ℃ 40 kHz的超聲波提取10，20，30，40和50 min，分析超聲波處理時(shí)間對(duì)Res提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Res提取率增加，當(dāng)超聲波處理時(shí)間為30 min時(shí)，提取率達(dá)到最大；超聲波處理時(shí)間超過(guò)30 min后，Res提取率下降，其原因可能是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，花生芽細(xì)胞破碎程度增強(qiáng)，溶出的Res增加，但繼續(xù)增加超聲波處理時(shí)間，Res的穩(wěn)定性會(huì)被破壞，導(dǎo)致含量降低，因此確定超聲波處理時(shí)間30 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)花生芽中Res提取率的影響

2.1.4 酶添加量對(duì)花生芽中Res提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份1.000 g花生芽粉，提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶40（g/mL），分別添加6，8，10，12和14 mg酶，在50 ℃條件下酶解1.5 h，經(jīng)40 kHz超聲波處理30 min，分析酶添加量對(duì)Res提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

當(dāng)酶添加量為8 mg時(shí)，Res提取率最大；繼續(xù)增加酶的添加量，Res提取率反而下降，其原因可能是大量纖維素酶過(guò)分分解花生芽，導(dǎo)致Res提取率下降。因此，酶添加量選擇8 mg左右為宜。

圖4 酶添加量對(duì)花生中Res提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以花生芽中Res提取率為響應(yīng)值，選取超聲波溫度（A）、超聲時(shí)間（B）、料液比（C）、酶添加量（D）為自變量，以Res的提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

利用Design-Expert V 8.0.6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，由花生芽中Res的濃度（Y）對(duì)超聲溫度（A）、超聲時(shí)間（B）、料液比（C）、酶添加量（D）建立回歸模型，對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到的四元二次回歸方程：

Y=+5.43+0.023A-0.097B+0.033C-0.046D-0.093AB+ 0.003 815AC+0.050AD-0.092BC+0.20BD-0.49CD-4.16A2+0.75B2+0.49C2+0.43D2

由表3可知，模型線性以及平方均顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，試驗(yàn)誤差小。回歸方程較好地描述了各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，因此，可以用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表3可知，所選取的因素對(duì)Res提取率的影響為B＞D＞C＞A，即超聲時(shí)間對(duì)Res提取率的影響最大，其次為酶添加量，最后是料液比和超聲溫度。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

由該回歸方程作出中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得的6組響應(yīng)面曲面圖，如圖5～圖10所示，以確定最佳提取工藝條件。由此可知，Res理論最大提取率為0.805 8 mg/g，其所對(duì)應(yīng)的提取條件為超聲溫度49.98 ℃，超聲時(shí)間35.00 min，料液比1∶34.99（g/mL），酶添加量7 mg。

根據(jù)軟件得到的結(jié)果，但考慮實(shí)際的操作性，建議對(duì)影響因素較小的超聲溫度和料液比進(jìn)行合理控制，將最佳反應(yīng)條件調(diào)整為超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間35 min，料液比1∶35（g/mL），酶添加量7 mg。在此條件下，Res提取率為0.823 9 mg/g，驗(yàn)證了方程的可靠性。

表3 回歸方程的方差分析

圖5 超聲時(shí)間和超聲溫度交互作用對(duì)花生芽中Res提取率的影響

圖6 料液比和超聲溫度交互作用對(duì)花生芽中Res提取率的影響

圖7 酶添加量和超聲溫度交互作用對(duì)花生芽中Res提取率的影響

圖8 料液比和超聲時(shí)間交互作用對(duì)花生芽中Res提取率的影響

圖9 酶添加量和超聲時(shí)間交互作用對(duì)花生芽中Res提取率的影響

圖10 酶添加量和料液比交互作用對(duì)花生芽中Res提取率的影響

2.3 驗(yàn)證比較試驗(yàn)

由表4可知，超聲波纖維素酶復(fù)合提取法的Res提取率最高。

表4 4種不同提取方法比較

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助纖維素酶提取花生芽中Res。結(jié)果表明，Res最佳提取工藝條件為超聲波處理溫度50 ℃，超聲波處理時(shí)間35 min，料液比1∶35（g/mL），酶添加量7 mg。在此條件下，Res的最大提取率可達(dá)0.823 9 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相接近。通過(guò)比較驗(yàn)證，結(jié)果表明超聲波輔助纖維素酶提取工藝能更有效地提取花生芽中Res，并優(yōu)于超聲波或纖維素酶單一提取工藝。花生發(fā)芽后大大提高了Res的含量，是Res的良好來(lái)源。花生發(fā)芽后提取Res，為花生仁的深加工提供了新的思路，并具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。