雙酶酶解制備黑小麥麩皮抗氧化肽

趙妍，路清宇

河南工業大學糧油食品學院（鄭州 450001）

黑小麥麩皮是一種優質的蛋白資源[1]，將黑小麥麩皮蛋白進行酶解得到具有抗氧化能力的活性肽，是一種開發麥麩蛋白的有效途徑。試驗采用黑小麥提取麩皮蛋白，通過雙酶分步酶解制得抗氧化肽，使用單因素試驗和正交法優化提取工藝，為黑小麥麩皮抗氧化肽的理論研究及其相關產品的開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小麥（農大876），泰安綠得農業有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）、風味蛋白酶（30 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g），北京索萊寶生物科技有限公司；總抗氧化能力測試盒、總蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-18MS高速冷凍離心機，上海盧湘儀器有限公司；Phs-3c酸度計，上海大普儀有限公司；LGJ-10C型冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠；TV-1819型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；Multiskan FC型酶標儀，賽默飛世爾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑小麥麩皮蛋白的提取

黑小麥潤麥磨粉得到麩皮，粉碎后過孔徑0.250 mm篩，加蒸餾水調節至料液比為1∶15（g/mL）后，調節pH到9，55 ℃振蕩60 min，離心（3 600 r/min）30 min取上清液，殘渣重復上述步驟。將2次上清液混勻，調節pH至4.8，離心（3 600 r/min）30 min，取沉淀冷凍干燥。

1.3.2 黑小麥麩皮蛋白的酶解

黑小麥麩皮蛋白加蒸餾水至濃度2%，調節pH，37 ℃攪拌15 min，加入酶進行酶解，控制時間和溫度，結束后將其置于92 ℃滅酶10 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液測水解度、肽得率及總抗氧化活性。用最優條件將第一步酶解進行至滅酶后，加入第二步酶進行酶解，重復上述操作測定3種指標，上清液冷凍干燥。

1.3.3 水解度（DH）測定

采用茚三酮比色法[2]。酶解液8 000 r/min離心15 min，取2 mL上清液，加入0.5 mL pH 8.04磷酸鹽緩沖液及0.5 mL 2%茚三酮溶液，沸水浴反應15 min，冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25 mL，搖勻靜置15 min，波長570 nm處比色，以空白試劑為參比，按式（1）進行計算。

式中：A為查表得蛋白質的毫克數；m為稱樣質量，g；V1為水解液的總體積，mL；V2為稀釋液的體積，mL。

1.3.4 總抗氧化活性（Trolox value）測定

根據總抗氧化活性試劑盒（ABTS快速法）測定[3]。依次加入10 μL樣品、20 μL過氧化物酶應用液及170 μL ABTS工作液于96孔板，室溫條件下反應6 min，使用酶標儀在波長405 nm處讀取各孔OD值。以蒸餾水為空白對照，Trolox為標準品，按式（2）進行計算。

式中：總抗氧化活性，μmol/g；cTrolox為樣品相當于Trolox的濃度，將OD值代入Trolox標準曲線得出，mmol/mL；m為黑小麥麩皮蛋白的質量，g；V為反應液的總體積，mL；n為稀釋倍數。

1.3.5 肽得率的測定

根據總蛋白定量測試盒（BCA法）測定[4]。依次加入20 μL樣品、雙蒸水、563 μg/mL標樣、250 μL工作液，混勻后37 ℃孵育30 min，加入750 μL終止劑應用液，再次混勻，靜置5 min后用雙蒸水調零。波長562 nm、光徑0.5 cm處測定其吸光度。

式中：ODs為測定OD值；ODb為標準OD值；OD0為空白OD值；標樣濃度為563 μmol/mL；n為稀釋倍數。

1.3.6 單因素試驗

采用5種蛋白酶酶解，條件設定為表1，根據水解度、總抗氧化活性及肽得率，篩選出兩步酶解所用的蛋白酶進行單因素試驗及正交優化試驗。

改變溫度（30，40，50，60和70 ℃）、pH（7，8，9，10和11）、時間（0.5，1，1.5，2，2.5和3 h）及酶添加量（6 000，10 000，14 000，18 000和22 000 U/g）中的1個因素，測定3種指標，選出第1種酶酶解時各因素最適宜的水平。采用第1種酶的最佳酶解參數進行酶解并滅酶后，加入第2種蛋白酶繼續酶解，同樣改變溫度（30，40，50，60和70 ℃）、pH（4，5，6，7和8）、時間（0.5，1，1.5，2和2.5 h）及酶添加量（2 000，6 000，10 000，14 000和18 000 U/g）中的1個因素，測定3種指標，選出各因素最適宜的水平。

表1 不同蛋白酶的水解條件

1.3.7 正交優化試驗

參照單因素試驗結果，以pH、溫度、時間及酶添加量為自變量，水解度、總抗氧化活性以及肽得率為因變量，設計四因素三水平試驗，各因素水平見表2和表3。

1.3.8 數據處理

試驗重復3次，分析時采用平均值計算。使用SPSS 20.0進行單因素及其方差分析，使用正交設計助手Ⅱ v3.1軟件進行正交分析，使用Origin 8.5軟件進行作圖。

表2 第一步正交試驗設計水平編碼表

表3 第二步正交試驗設計水平編碼表

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

由圖1可知，經堿性蛋白酶酶解，肽得率和總抗氧化活性均明顯高于其余3種酶，水解度僅次于風味酶，因此選堿性蛋白酶為第一步水解用酶。經風味酶酶解，水解度最高，總抗氧化活性僅次于堿性蛋白酶，所以選風味酶為第二步水解用酶。

圖1 酶種類對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

2.2 堿性蛋白酶單因素試驗結果

2.2.1 溫度對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖2可知，溫度較低時，3種指標均隨溫度升高而升高；而溫度超過50 ℃，則3種指標均呈下降趨勢。這是因為蛋白酶有自身的有效溫度及最適溫度，在有效溫度范圍內才具有酶解催化作用；在最適溫度下，其酶活性最強，催化酶解效果最佳[5]。溫度過高或過低時，酶活性不佳，不利于多肽的生成，使得水解度與肽得率降低，影響抗氧化活性，因此將50 ℃定為堿性蛋白酶酶解的最佳溫度。

2.2.2 加酶量對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖3可知，酶添加量較少時，3種指標均逐漸升高；酶添加量從18 000 U/g升高到22 000 U/g時，3種指標基本保持穩定。這是因為底物濃度不變時，酶添加量決定了酶解后多肽的生成量，當足夠的酶與底物反應后，多肽的生成量最高[6]，此時底物可能已經被酶解完全，因此選擇18 000 U/g作為酶解的最適添加量。

圖2 溫度對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

圖3 加酶量對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

2.2.3 時間對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖4可知，當酶解時間較短時，3種指標均逐漸升高，酶解時間高于2 h后，3種指標均保持穩定。這是因為酶解時間較短時，底物中酶解位點充足，反應速度快，水解度等相關指標增加較快[5]；酶解時間延長后，底物中酶解位點變少，反應速度變慢，3種指標均逐漸達到了最大值；此后一些多肽又被進一步酶解，降低了酶解產物的總抗氧化活性[7]。因此酶解最佳時間為2 h。

圖4 時間對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

2.2.4 pH對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖5可知，當pH較低時，3種指標均逐漸增加，pH超過9后3個指標均呈下降趨勢。這是因為pH會影響氨基酸殘基的解離狀態，改變酶的空間結構，從而影響酶解進程[8]。當pH處于蛋白酶最適pH范圍內時，酶的催化反應速度最快，效果最佳；而pH過高或過低易造成酶變性失活[5]。因此選擇pH 9作為最適pH。

2.3 堿性蛋白酶正交試驗結果

由表4～表7可知，3種不同條件分別對3種指標具有不同的顯著與極顯著影響。由表4可知，堿性蛋白酶酶解黑小麥麩皮蛋白的最優組合為A2B2C2D2，即pH 9，時間2 h，溫度50 ℃，酶添加量18 000 U/g。選擇該條件進行黑小麥麩皮蛋白的第一步酶解。

圖5 pH對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

表4 正交試驗直觀分析表

表5 水解度方差分析表

表6 肽得率方差分析表

表7 總抗氧化活性方差分析表

2.4 風味蛋白酶單因素試驗結果

圖6 溫度對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

圖7 pH對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

由圖6和圖7可知，當溫度和pH較低時，3個指標均有一定的升高；處于50 ℃以及pH 6時，3個指標均到達最高值；而溫度和pH繼續升高，這3個指標均出現下降的趨勢，因此將50 ℃和pH 6分別定為風味蛋白酶酶解的最佳溫度和最適pH。

由圖8和圖9可知，當酶添加量較少及時間較短時，3個指標均呈現逐漸升高的趨勢；當酶添加量從10 000 U/g升高到18 000 U/g，時間從1.5 h到2.5 h，3個指標均保持穩定，變化幅度較小。因此分別選擇10 000 U/g和1.5 h作為風味蛋白酶的最適添加量和最佳酶解時間。

圖8 加酶量對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

圖9 時間對水解度、總抗氧化活性及肽得率的影響

2.5 風味蛋白酶正交試驗結果

由表8～表11可知，不同條件分別對3種指標具有不同的顯著與極顯著影響。由表8可知，風味蛋白酶酶解黑小麥麩皮蛋白的最優組合為A2B2C3D2，即pH 6，時間2 h，溫度50 ℃，酶添加量10 000 U/g，選擇該條件進行黑小麥麩皮蛋白的第二步酶解。

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接表8

試驗號 A pH B溫度 C時間 D加酶量 水解度/% 肽得率/% 總抗氧化活性/(μmol·g-1) k2 20.04 20.26 18.83 18.90 k3 17.65 17.91 19.09 18.46 R 2.39 2.95 1.53 0.78水解度 B＞A＞C＞D k1 41.21 39.75 40.45 40.85 k2 46.34 47.32 43.20 43.82 k3 40.06 40.54 43.95 42.93 R 6.29 7.57 3.50 2.97肽得率 B＞A＞C＞D k1 6.98 6.89 6.89 6.98 k2 7.63 7.63 7.33 7.31 k3 7.00 7.09 7.40 7.32 R 0.65 0.74 0.51 0.34總抗氧化活性 B＞A＞C＞D

表9 水解度方差分析表

表10 肽得率方差分析表

表11 總抗氧化活性方差分析表

3 結論

試驗采用堿性蛋白酶和風味酶對黑小麥麩皮蛋白進行分步酶解。根據各自單因素試驗進行正交優化，最佳工藝條件為第一步使用堿性蛋白酶酶解，pH 9，酶活添加量18 000 U/g，時間2 h，溫度50 ℃；此時水解度為11.46%，肽得率為38.33%，總抗氧化活性為6.65 μmol/g。第二步使用風味酶酶解，pH 6，溫度50 ℃，時間2 h，酶活添加量10 000 U/g；此時水解度為22.74%，肽得率為52.36%，總抗氧化活性為8.47 μmol/g。