鐵皮石斛花色苷提取及其抗氧化活性分析

楊曉娜，陳自宏，謝雯穎，吳春燕，張星和

保山學院資源與環境學院（保山 678000）

花色苷是植物次生代謝過程中產生的類黃酮物質，它是花色素與糖以糖苷鍵結合而成的天然色素，不僅安全，且在動脈粥樣硬化、炎癥、癌癥等疾病中有一定的治療作用[1]。國內外科研工作者已對不同植物花色苷的提取工藝做了大量的研究，微波加熱使細胞內極性物質吸收微波能，產生熱量，破壞植物細胞壁，并將胞內物質釋放出來[3]。經查閱文獻，植物花色苷微波輔助提取及其抗氧化性研究成果較多，主要集中在紫洋蔥[4]、石榴[5]、紅米[6]、紫薯[7]、紫馬鈴薯[8]、黑果枸杞[9]等植物，但是微波輔助提取鐵皮石斛花色苷及其抗氧化性研究鮮有報道。

云南省保山市是我國蘭科石斛屬植物分布較集中的地區之一，獨特的氣候條件和多樣的生態環境，為石斛屬植物的生長提供了有利條件[2]。目前，對石斛的研究主要集中在資源、繁殖生長、活性成分及功能、組織培養、資源鑒定與評價、化學成分、內生菌、藥理作用等方面。通過對保山不同品種石斛的調研，發現鐵皮石斛葉鞘富含天然色素花色苷。

因此，此次試驗在傳統浸泡法基礎上，加以微波輔助提取鐵皮石斛花色苷，并對其進行抗氧化性研究，以了解鐵皮石斛花色苷用微波輔助提取的工藝及其對清除DPPH自由基和羥自由基的抗氧化能力，為石斛天然色素開發提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛采自龍陵縣龍江鄉石斛人工種植基地，選用長勢好、無病蟲害的鐵皮石斛葉鞘作為試材，自然干燥后用粉碎機粉碎，過60目篩，密封保存，備用。無水乙醇、鹽酸、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、水楊酸、過氧化氫等均為分析純。

1.2 儀器與設備

DFY-800 g搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；DK-8AX電熱恒溫水槽（上海一恒科技儀器有限公司）；G70F20N2L-DG（SO）微波（廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司）；N-1001旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；HC-2062離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；SHZ-DⅢ循環水真空泵（鞏義市子華儀器有限責任公司）；UV5100紫外/可見分光光度計（安徽皖儀科技股份有限公司）；CP114電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛花色苷含量測定及最大吸收波長的確定方法

稱取1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分數為40%）浸泡1 h，然后在微波輻射功率406 W、輻射時間60 s條件下處理，抽濾，將提取液置于紫外-可見分光光度計200～700 nm波長范圍內掃描，確定最大吸收波長[10]。

用pH示差法測定花色苷的含量[11]，分別用pH 1.0的KCl和pH 4.5的乙酸鈉緩沖液定容至25 mL，室溫下平衡20 min，測定2份樣品在λmax和700 nm波長處的吸光度。吸光度及紫皮石斛提取液中花色苷含量按式（1）和（2）計算。

式中：V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質量，449.4；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數，26 900；m為樣品質量，g。

1.3.2 浸泡時間

稱取6份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分數為40%），分別浸泡0，1，2，3，4和5 h，然后在微波輻射功率406 W、輻射時間60 s條件下處理，抽濾，測定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.3 乙醇體積分數

稱取5份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，分別加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇，乙醇體積分數分別為30%，40%，50%，60%和70%，浸泡1 h，然后在微波輻射功率406 W，輻射時間60 s條件下處理，抽濾，測定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.4 料液比

稱取5份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，分別加入20，25，30，35和40 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分數均為40%），浸泡1 h，然后在微波輻射功率406 W、輻射時間60 s條件下處理，抽濾，測定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.5 輻射時間

稱取5份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分數為40%），浸泡1 h，然后在微波輻射功率406 W、輻射時間分別為30，60，90，120和150 s條件下處理，抽濾，測定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.6 輻射功率

稱取4份1 g鐵皮石斛葉鞘粉末，加入30 mL 0.1%鹽酸乙醇（乙醇體積分數為40%），浸泡1 h，然后在輻射時間60 s，微波輻射功率分別為126，406，567和700 W條件下處理，抽濾，測定提取液中花色苷的含量，方法同1.3.1。

1.3.7 正交試驗方法

在單因素試驗的基礎上，選擇浸泡時間、乙醇體積分數、料液比、輻射時間、輻射功率進行五因素四水平正交試驗設計，采用L16(45)正交表進行試驗，以提取液中花色苷含量為考察指標，確定最佳工藝參數。

表1 正交因素水平

1.3.8 DPPH清除自由基能力的測定方法

稱取0.019 7 g DPPH，用無水乙醇定容至100 mL，避光保存，備用。將花色苷溶液用二倍稀釋法稀釋5組，備用。按表2中試驗內容，在比色管中將溶液混勻，避光室溫保存30 min后，定容至10 mL，在517 nm波長處測吸光度，重復3次試驗，計算清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%和IC50值清除率。采用VC作對照，VC的濃度和花色苷相同，同樣采用二倍稀釋法配制5組不同濃度的VC溶液。操作步驟和計算公式與花色苷一致。

表2 DPPH清除自由基能力測定方法

1.3.9 羥自由基清除能力的測定方法

分別配置6 mmol/L水楊酸（稱取0.041 4 g水楊酸，用無水乙醇定容50 mL）、6 mmol/L硫酸亞鐵（稱取0.083 4 g硫酸亞鐵，用蒸餾水定容50 mL）和0.3%過氧化氫溶液（移取0.5 mL 30%過氧化氫，用蒸餾水定容50 mL，現配）。用A0組的混合液在200～700 nm下測定最大吸收波長。按表3的試驗內容在比色管中將A0組、A1組、A2組溶液加好后，在37 ℃進行水浴加熱30 min，再用蒸餾水定容至10 mL，在紫外/可見分光光度計測λmax的吸光度A，重復3次試驗，計算清除率= [1-（A1-A2）/A0]×100%和IC50值清除率。采用VC作對照，VC的濃度和花色苷相同，同樣采用二倍稀釋法配制5組不同濃度的VC溶液。操作步驟和計算公式與花色苷一致。

表3 羥自由基清除能力測定方法

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛花色苷最大吸收波長的確定

從圖1可以看出，鐵皮石斛最大吸收波長為530 nm。王立江等[12]以黑馬鈴薯鮮樣為試驗材料，采用微波輔助有機溶劑提取法對黑馬鈴薯中花色苷的提取工藝條件進行優化，黑馬鈴薯花色苷的最大吸收波長在536 nm處。蔣海偉等[13]采用酸化乙醇作為提取劑，微波輔助提取紅米中花色苷，其最大吸收波長在517 nm。任虹等[14]研究蒸汽加熱和微波加熱處理對紫甘藍花色苷及其清除自由基活性的影響，紫甘藍花色苷最大吸收波長在500 nm處。根據文獻可知花色苷及其色素元在可見光465～550 nm波長范圍內有吸收峰[15]。由此可以判斷鐵皮石斛色素屬花色苷[16]。

圖1 鐵皮石斛花色苷可見光譜圖

2.2 單因素對花色苷提取的影響

2.2.1 浸泡時間對花色苷提取的影響

由圖2可知，當浸泡時間小于4 h時，隨著浸泡時間的增加，鐵皮石斛花色苷的提取含量逐漸增大；當浸泡時間超過4 h后，鐵皮石斛花色苷的含量又開始下降，其原因可能是浸泡時間過長，提取劑過多進入細胞，加以微波輔助提取，細胞內其他物質不斷被提取出來，影響花色苷的含量。所以，浸泡時間4 h為提取鐵皮石斛花色苷最適宜的浸泡時間。

2.2.2 乙醇體積分數對花色苷提取的影響

由圖3可知，當乙醇體積分數在30%～50%之間，鐵皮石斛花色苷提取含量隨乙醇體積分數增大而增大，且當乙醇體積分數為50%時，鐵皮石斛花色苷的含量最高。但當乙醇體積分數超過50%時，增大乙醇體積分數，花色苷含量反而呈下降趨勢。其原因可能是乙醇體積分數過高，將鐵皮石斛中其他易溶于乙醇的有機物也一起提取出來。所以，乙醇體積分數50%作為提取鐵皮石斛花色苷的最佳提取劑乙醇體積分數。

圖2 浸泡時間對鐵皮石斛花色苷含量的影響

圖3 乙醇體積分數對鐵皮石斛花色苷含量的影響

2.2.3 料液比對花色苷提取的影響

由圖4可知，料液比在1∶20～1∶25（g/mL）內，隨著提取劑體積的增加，花色苷含量逐漸增大，且上升很大。但是繼續增加提取劑體積，花色苷含量緩慢下降。其原因可能是料液比大，提取劑體積大，加熱時間長，溫度高，使得花色苷降解。倘若一開始料液比過大，則不利于下一步的濃縮分離以及增加后面的工作能耗，所以結合經濟角度考慮，選擇1∶25（g/mL）作為最佳料液比。

2.2.4 輻射時間對花色苷提取的影響

由圖5可知，當輻射時間為30～60 s時，花色苷含量呈上升趨勢。在60～120 s，花色苷含量呈下降趨勢；但在120 s之后，增大輻射時間，花色苷含量又上升。其原因可能是在輻射時間在60～120 s時，加熱時間過長，加熱溫度升高，使花色苷受到一定的破壞；在150 s，花色苷含量又增大，可能是因為微波提取過程中，電磁波把能量直接傳遞到鐵皮石斛內部并快速加熱，使溫度快速升高，使得一些未溶于提取劑的其他色素溶解一并被提取出來，增大花色苷含量。但是從節約資源、省時、省電角度考慮，150 s耗時過長，而且后期提純工藝較繁瑣，所以選擇60 s作為最適提取時間。

圖4 料液比對鐵皮石斛花色苷含量的影響

圖5 輻射時間對鐵皮石斛花色苷含量的影響

2.2.5 輻射功率對花色苷提取的影響

由圖6可知，微波功率在126～567 W內，隨著微波提取功率的增加，鐵皮石斛花色苷含量呈逐漸上升的趨勢，且在567 W時花色苷含量最高。但是，繼續增加微波提取功率，其含量增加呈緩慢下降的趨勢，這是由于微波功率過大易造成溫度過高，使部分花色苷分解，進而降低花色苷的提取含量。所以選擇567 W為提取最適功率。

2.3 鐵皮石斛花色苷正交試驗結果分析

由表4可知，采用微波輔助提取鐵皮石斛花色苷，在5個單因素影響中，乙醇體積分數極差為0.037，是對提取花色苷含量影響最小的，而料液比極差最大，影響也最大，為主要影響因素，各因素對提取花色苷含量的影響依次是料液比＞輻射時間＞浸泡時間＞乙醇體積分數＞輻射功率。綜合所有試驗結果，試驗最終確定的最佳參數為乙醇體積分數為50%，料液比為1∶20（g/mL），輻射功率為406 W，輻射時間為90 s，浸泡時間為4 h。從表5中可以看出，4個因素顯著水平值均為極顯著，說明這4個因素對試驗的結果有顯著影響。

圖6 微波功率對鐵皮石斛花色苷含量的影響

表5 方差分析

表4 正交試驗及結果

2.4 最佳工藝條件驗證試驗、提取次數

根據正交試驗可知，最佳提取工藝參數為A2B1C2D3E4，即乙醇體積分數為50%，料液比為1∶25（g/mL），微波功率為406 W，輻射時間90 s，浸泡時間4 h，按此試驗條件再進行3次重復試驗，提取鐵皮石斛花色苷含量為0.452，0.435和0.392 mg/g，3組鐵皮石斛花色苷含量與正交試驗中第5組含量相差不大，說明該組試驗提取穩定，因此確定A2B1C2D3E4為最佳提取工藝。

由圖7可知，當提取條件為A2B1C2D3E4時，提取2次，鐵皮石斛花色苷含量最高，為1.052 mg/g，花色苷質量濃度為35.07 mg/L；提取3次時，花色苷含量又降低，但含量比提取1次含量高。提取3次，鐵皮石斛花色苷含量有所下降的原因可能是：提取2次，鐵皮石斛濾渣已呈無色，第3次同樣條件提取，提取液幾乎呈無色，花色苷色素幾乎提取完畢，再次提取，反而將濾渣中的多糖或者其他成分提取出來，影響最終的花色苷的含量。所以3最終確定以提取次數2次最佳。

圖7 提取次數對鐵皮石斛花色苷含量的影響

2.5 鐵皮石斛花色苷對羥自由基的清除能力

羥自由基是人體內危害性較強的一種自由基，與機體內分子失電子或電子轉移，來影響機體正常的生理功能。硫酸亞鐵被過氧化氫氧化為Fe3+，再與水楊酸反應形成紫色絡合物，加入自由基清除劑后，紫色絡合物顏色變淺，且清除劑濃度越高，顏色越淺。由圖8可知，鐵皮石斛花色苷質量濃度在2.2～35.07 μg/mL范圍內，花色苷質量濃度增大，清除率越大，呈上升趨勢，而VC的清除率趨于平緩，當花色苷質量濃度達到35.07 μg/mL時，清除率達到97.8%。用SPSS 18.0軟件分析IC50得：鐵皮石斛花色苷的IC50（7.61 μg/mL）＞VC的IC50（5.56×1020μg/mL）。鐵皮石斛花色苷具有較強的清除羥自由基的能力，抗氧化能力強于VC。

2.6 鐵皮石斛花色苷對DPPH自由基的清除能力

DPPH是一種紫紅色物質，DPPH自由基溶于乙醇且能穩定存在，當有自由基清除劑加入與之結合，會使顏色變淺，且與清除劑濃度呈一定的量效關系。由圖2可知，鐵皮石斛花色苷質量濃度在0.3～35.07 μg/mL范圍內，花色苷濃度增大，清除率越大，呈上升趨勢，而VC的清除率趨于平緩，當花色苷質量濃度達到35.07 μg/mL時，清除率達到97.8%，VC清除率為56.7%。用SPSS 18.0軟件分析IC50得：鐵皮石斛花色苷的IC50（0.53 μg/mL）＞VC的IC50（74.46 μg/mL）。鐵皮石斛花色苷具有較強的清除DPPH自由基的能力，抗氧化能力強于VC。

圖8 鐵皮石斛花色苷及VC對羥自由基的清除能力比較

圖9 鐵皮石斛花色苷及VC對DPPH的清除能力

3 結論

此次試驗利用浸泡-微波輔助聯合方法提取鐵皮石斛花色苷，得出鐵皮石斛花色苷的最大吸收波長，為530 nm；由單因素試驗及正交試驗結果可知，各因素對提取花色苷含量的影響依次是料液比＞輻射時間＞浸泡時間＞輻射功率＞乙醇體積分數。最佳提取參數為乙醇體積分數50%，料液比為1∶20（g/mL），輻射功率406 W，輻射時間90 s，浸泡時間4 h，提取次數2次。此時，鐵皮石斛花色苷含量最高，為1.052 mg/g，花色苷質量濃度為35.07 mg/L。通過軟件分析IC50，鐵皮石斛花色苷對清除羥自由基和DPPH自由基的IC50分別為7.61和0.53 μg/mL。VC對清除羥自由基和DPPH自由基IC50分別為5.56×1020和74.46 μg/mL。鐵皮石斛花色苷對DPPH自由基和羥自由基均有較強的抗氧化能力，抗氧化效果均強于VC，且抗氧化能力與花色苷濃度顯現出一定的正比關系，但對DPPH自由基的抗氧化能力要強于羥自由基。