獼猴桃籽油微膠囊在Caco-2單細胞層的吸收特性

徐姍姍 ，馬永慶，王憬，谷瑞增，劉文穎*

1. 浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室（寧波 315832）；2. 中國食品發酵工業研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心（北京 100015）

獼猴桃是獼猴桃科多年生藤本植物果實的總稱，是一類形態特別、風味鮮美、營養豐富的特色水果。作為獼猴桃加工的副產品，獼猴桃籽含油量在23.50%～28.85%之間，獼猴桃籽油中α-亞麻酸含量高達63.99%[1-2]。α-亞麻酸是人體必需脂肪酸，只能通過飲食攝取。作為一種多元不飽和脂肪酸，α-亞麻酸極易受空氣中的光、氧、水分等環境因素影響發生氧化變質。油脂經過微膠囊化，可使其免受外界因素影響，能有效解決油脂貯存問題[3-4]。

玉米肽是從天然食品玉米中提取的玉米蛋白，經適度水解而獲得的小分子肽物質。其天然安全，易被人體吸收，并具有抗氧化、降血壓等特殊的生理功能[5-6]。目前，國內外采用食源性肽作為包埋壁材的研究還較為鮮見。以玉米肽作為壁材，既可發揮其抗氧化活性保護芯材的作用，本身也可作為營養物質，易于被機體吸收。

此次試驗以玉米肽為壁材，以獼猴桃籽油為芯材，制備獼猴桃籽油微膠囊，并首次對其在Caco-2細胞模型中的吸收特性進行研究，以期為玉米肽的應用開拓新的思路，為亞麻酸產業和獼猴桃產業的深入開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

獼猴桃籽油（吉安市青原區綠源天然香料油提煉廠，經超臨界CO2萃取制得）；玉米黃粉（北京中食海氏生物技術有限公司）；石油醚、甲醇、三氯甲烷、NaOH（北京化工廠，分析純）；吐溫-20（天津市興復精細化工研究所）；MEM（Minimum Essential Medium）培養基（美國Life Technologies公司）；FBS（超濾胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素鏈霉素溶液（雙抗，上海碧云天生物技術有限公司）；DMSO（二甲基亞砜，分析純，西隴化工股份有限公司）；MTT（四甲基偶氮唑鹽，美國Sigma公司）。

1.1.2 儀器與設備

JB-1A磁力攪拌器（上海精科儀器有限公司）；YC-1000噴霧制粒包衣機（上海雅程儀器設備有限公司）；LG10-2.4A離心機（北京時代北利離心機有限公司）；T25 Digital高速分散機（上海珂淮儀器有限公司）；Cell Zscope全自動跨膜電阻測量儀（英國Nano Analysis公司）；Thermo Hera Cell 240i CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；AccuriC6流式細胞儀（美國BD公司）；DL-CJ-1N超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 玉米肽的制備

臨床中房顫與血栓栓塞性事件密切相關，血栓栓塞也是非瓣膜性房顫患者發生殘疾與死亡的重要原因之一，故血栓栓塞也是治療房顫的重要目標。

將玉米黃粉溶解于蒸餾水中（質量濃度8%），經均質機均質，用NaOH調整pH至8.5，放入50 ℃水浴鍋中。以每克原料3 000單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2 h，再調節pH至7.0，以每克蛋白質3 000單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h。然后于100 ℃滅酶15 min。再用離心機以5 000g離心10 min，取上清液。用截留相對分子質量為1 000 U的超濾膜超濾，得到相對分子質量＜1 000 U的濾過液，進行噴霧干燥，最終得到玉米肽干粉。

1.2.2 獼猴桃籽油微膠囊的制備

采用噴霧干燥法[7]。準確稱取一定量的玉米肽粉溶解于蒸餾水中，加入獼猴桃籽油（芯材壁材比為1∶2）和0.5%的吐溫-20，固形物濃度為15%。在60 ℃恒溫水浴鍋中以500 r/min攪拌20 min，然后用高速分散機以6 000 r/min剪切乳化，形成穩定的乳狀液。最后于160 ℃進行噴霧干燥，得到獼猴桃籽油微膠囊。

1.2.3 獼猴桃籽油微膠囊包埋率的測定

準確稱取2 g獼猴桃籽油微膠囊于加塞三角瓶中，加入15 mL石油醚，振蕩3 min，用離心機以6 000 r/min離心5 min，重復3次，合并上清液，濃縮后置于干燥的表面皿中，石油醚揮干后，用減重法得到獼猴桃籽油微膠囊表面油含量（m1）。

準確稱取2 g獼猴桃籽油微膠囊于加塞三角瓶中，加入7.5 mL甲醇，超聲振蕩5 min后，加入17.5 mL三氯甲烷，超聲振蕩5 min，過濾后用三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）將溶液混合，倒入已恒質量的燒杯中，蒸干溶劑，冷卻5 h，用減重法得到獼猴桃籽油微膠囊總油含量（m2）。微膠囊包埋率按式（1）計算。

1.2.4 獼猴桃籽油微膠囊的感官評價

1.2.5 獼猴桃籽油微膠囊的理化性質

水分含量的測定，參照GB 5009.3—2016[8]測定水分含量；參考文獻[9]的方法測定堆密度；參照GB 5413.29—2010[10]測定溶解度。

1.2.6 MTT法

將細胞復蘇并在37 ℃，5% CO2的培養箱中培養并傳2～3代，待細胞生長至培養瓶的80%～90%時，用胰酶裂解液對其消化，制得單細胞懸液，并用流式細胞儀計數。用培養基稀釋細胞至所需濃度1×105cell/mL，并接種于96孔板上，每孔加100 μL細胞液。培養24 h后，即細胞單層貼壁后，棄掉板內培養基。加入8個濃度的試驗樣品，每孔100 μL，用不含FBS的培養基將樣品稀釋至所需濃度，空白對照也采用不含FBS的培養基，再培養24 h。倒掉孔中培養液，在每孔中加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT培養液。培養4 h后，去掉孔內上清液，向加有細胞液的孔中加入100 μL DMSO，平行適度振蕩96孔板，使胞內的紫色結晶物充分溶解。在酶標儀上選擇波長490 nm進行測定。細胞增殖率按式（2）計算。

1.2.7 Caco-2單細胞層的建立

將Caco-2細胞用含15%胎牛血清的完全培養基于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養，待細胞接近80%融合時，用完全培養基將細胞濃度稀釋為1×105cell/mL，接種于6孔Transwell板的上側，下側加入2.5 mL完全培養基，每隔1 d換液1次，直到細胞分化成單層細胞。通過跨膜電阻儀檢測細胞完整性，當跨膜電阻達到400 Ω/cm2時，細胞可用于轉運試驗。

1.2.8 獼猴桃籽油微膠囊在Caco-2細胞中的吸收

Caco-2細胞在Transwell板上形成緊密完整的細胞單層后，用PBS沖洗板中各孔室的細胞3次，然后在每個孔室中加入1 mL的PBS，并放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養30 min，吸棄細胞膜表面的附著物、培養基質和PBS緩沖液。用PBS將獼猴桃籽油微膠囊稀釋至高、中、低3個質量濃度（100，200和400 μg/mL），用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。樣品液從AP側至BL側的過膜試驗操作：在AP側加入250 μL樣品液，BL側加600 μL的PBS，放入CO2培養箱中繼續培養1 h，然后分別在BL側中收集500 μL過膜液，每組3個復孔。采用氣相色譜檢測2 h后下方濾液中的樣品濃度，計算微膠囊的表觀滲透系數Papp和生物利用率，按式（3）和（4）計算。

式中：dQ/dt為單位時間樣品轉運量，μg/s；A為轉運膜面積，此時A為1.12 cm2；C0為樣品的初始濃度，μg/L。

1.2.9 數據統計分析

每組試驗做3次，采用SPSS 20.0數據統計分析軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 獼猴桃籽油微膠囊的感官評價和理化性質

試驗所得的獼猴桃籽油微膠囊為淡黃色粉末狀固體，無結塊、雜質，有香氣。包埋率為93.96%，水分含量為3.28%，水分含量較低，較為干燥，易于保存。堆密度為0.22 g/cm3，這表明微膠囊產品間空隙大，流動性好。溶解度在95%以上，溶解性和復溶性能良好。

2.2 微膠囊對細胞增殖的影響

采用MTT法測定不同濃度獼猴桃籽油微膠囊產品對Caco-2細胞增殖的影響，結果如圖1所示。在10，20，40，80，100，200，400和800 μg/mL 8個質量濃度范圍內，細胞增殖率均大于80%，可認為微膠囊產品對Caco-2細胞均沒有顯著的毒害作用（p＜0.01）[11]，其中微膠囊溶液質量濃度為10和20 μg/mL時，其對細胞增殖有一定抑制作用，但無顯著性差異；隨著樣品濃度的增加，其對細胞增殖的促進作用呈線性關系；當作用質量濃度達到400 μg/mL時，細胞增殖率達124%。綜合考慮產品的細胞毒理學，最終采用100，200和400 μg/mL的質量濃度作為Caco-2細胞吸收試驗的作用濃度。

圖1 微膠囊對Caco-2細胞存活率的影響

2.3 Caco-2細胞形態學結果分析

如圖2所示，經過1 d培養，細胞為不規則的扁形，呈片狀分布；培養至20 d時，細胞生長均勻，形態完整，無白泡，細胞之間連接緊密，呈“鋪路石”狀，具有明顯上皮細胞特征。但細胞是否形成了致密單層膜，還需要進行進一步驗證。

圖2 Caco-2細胞在Transwell板上培養單層膜形態圖

2.4 Caco-2細胞模型TEER值測定

如圖3所示，隨著培養時間的增加，Caco-2細胞單層的TEER值逐漸變大。初始的1周增長平緩，隨后增加變快，當培養到13～14 d時，TEER值接近300 Ω·cm2，說明Caco-2細胞已分化完全，可以用于小腸吸收試驗。此次試驗中，Caco-2細胞培養21 d后用于試驗，TEER值＞400 Ω·cm2。基于上述指標結果，此次試驗建立的Caco-2細胞模型在細胞形態學和跨膜電阻值方面均符合要求，與小腸上皮細胞相似，可以利用此模型進行吸收試驗。

2.5 微膠囊在Caco-2細胞模型中的吸收

基于MTT試驗結果，選擇100，200和400 μg/mL的微膠囊溶液濃度進行吸收試驗。向AP側小室加入樣品液，與分化的細胞進行共同培養，收集BL側透過細胞單層的濾液，進行氣相色譜分析，根據峰面積得出濾液濃度，計算生物利用度。

在2 h觀察利用Caco-2單層細胞模擬小腸吸收模型對微膠囊的吸收情況，分析0 h和細胞吸收后（2 h）氣相色譜圖的變化，計算產品的Papp和生物利用率。由圖4可知：獼猴桃籽油微膠囊的生物利用率與濃度呈負相關，在高、中、低3個質量濃度下生物利用率均高于25%。當微膠囊質量濃度為100 μg/mL時，生物利用率達到最高，為41.70%±1.65%，此濃度下從AP側到BL側的表觀滲透系數為2.8×10-7cm·s-1，在1×10-7～1×10-6cm·s-1之間，說明微膠囊的吸收水平較好。獼猴桃籽油中主要成分亞油酸和α-亞麻酸屬于長鏈脂肪酸，需要與細胞中的脂肪酸結合蛋白質（FABP）結合，轉運至滑面內質網酯化[12]，再經淋巴入血，需要一定的吸收時間。

圖3 Caco-2細胞跨膜電阻值隨時間變化

圖4 微膠囊的生物利用率（p＜0.05）

3 結論

以玉米肽為壁材，以獼猴桃籽油為芯材，采用噴霧干燥法，制備獼猴桃籽油微膠囊。采用MTT法，考察獼猴桃籽油微膠囊對Caco-2細胞增殖的影響，以確定吸收試驗選用的樣品濃度。當微膠囊質量濃度較低時，其對Caco-2細胞有較低的抑制作用。隨著質量濃度的上升，100～400 μg/mL的樣品對細胞增殖有促進作用，且呈線性相關。建立Caco-2單層細胞模型，模擬小腸上皮細胞進行體外吸收研究。經過21 d的培養，細胞形態接近上皮細胞，TEER值大于400 Ω·cm2，表明Caco-2細胞分化形成了完整致密的單層結構。加入100，200和400 μg/mL 3個質量濃度的樣品液，采用氣相色譜，測定微膠囊產品通過細胞單層的濃度，計算其表觀滲透系數Papp和生物利用率。結果顯示，在高、中、低3個質量濃度下微膠囊的生物利用率均高于25%。當質量濃度為100 μg/mL時，微膠囊的生物利用率達到最高，為41.70%±1.65%，從AP側到BL側的Papp系數在1×10-7～1×10-6cm·s-1之間，說明微膠囊的吸收水平較好。此次試驗為玉米肽的應用開拓了新的思路，為亞麻酸產業和獼猴桃產業的深入開發提供了理論依據。