HPLC同步測定禿瘡花中紫堇丁堿同分異構體的含量

倪居，田野，張效斌，高金鑫，張衛，周樂

1. 鄭州鐵路職業技術學院（鄭州 451460）；2. 河南職業技術學院烹飪食品與健康學院（鄭州 450046）；3. 西北農林科技大學化學與藥學院（楊陵 712100）

禿瘡花[Dicranostigma leptopodum（maxim.）Fedde，DLF][1]，又名滇川禿瘡花、禿子花、紅茂草、勒馬回（陜西），屬于罌粟科禿瘡花屬。帶根全草民間供藥用，春夏采集，曬干；性涼，苦澀味，有毒；有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲的功效；用于治療扁桃體炎、牙痛、咽喉痛、淋巴結核，主治咽喉痛、扁桃體炎、齒齦腫痛、禿瘡、瘰疬、癤瘡、尋常疣、疥癬、癰疽、頭癬、體癬等。現代藥理研究證明，傳統中草藥禿瘡花提取物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、殺蟲等多種藥理活性[2-4]。禿瘡花化學成分主要為多種異喹啉類生物堿[5]。其中，生物堿包括阿樸啡型、原小檗堿型、原阿片堿型，對癌細胞系如SMCC-7721、A549、HT-29、KB和p388等癌細胞具有較強的細胞毒性，可抑制癌細胞增殖[6]，可能是禿瘡花抗腫瘤活性的物質基礎。

工藝研究指出異紫堇丁堿在該植物中的含量較高[7]，并且具有強的抗腫瘤活性。然而有關同步提取分離和HPLC同步測定紫堇丁堿同分異構體的方法未見文獻報道。試驗采用超聲提取法和硅膠柱層析法分離純化紫堇丁堿和異紫堇丁堿，通過HPLC同時測定其含量，以期為禿瘡花的有效利用和資源開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

禿瘡花為花期全草，2018年5月采自陜西省西北農林科技大學北校園區。經過西北農林科技大學苗芳教授鑒定為禿瘡花（Dicranostigma leptopodum（Maxim.）Fedde）。自然風干，粉碎后用孔徑0.150 mm篩篩分，密封，4 ℃冰箱保存備用。

1.2 主要試驗試劑

甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、氨水、氫氧化鈉等（分析純，天津市津東天正精細化化學試劑廠，天津市富宇精細化工有限公司）；48～74 μm氧化鋁、GF254薄層層析硅膠、74～149 μm和48～74 μm柱層析硅膠（青島海洋化工廠）；0.5% CMC、110 ℃活化GF254薄層層析硅膠（自制）；羧甲基纖維素鈉（CMC）（南京化學試劑公司）；75%乙醇、95%工業乙醇（山東安捷高科公司）；色譜純甲醇（德國默克）；超純水（上海和泰）。

1.3 主要試驗儀器

KQ-500DE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JPCT-20L型超聲提取器（無錫久平儀器有限公司）；WFH-203三用紫外分析儀（上海光譜儀器有限公司）；BC-R206型旋轉蒸發器（上海貝凱生物化工設備有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；HPLC（Waters公司）；C-18反相色譜柱（Merk公司）；CP224C萬分位電子分析天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；YP30002電子天平（上海越平科學儀器蘇州制造有限公司）。

E2695 Waters高效液相色譜儀；1525-2707 TCM-2489色譜系統（Water 1525 Binary HPLC Pump，Water 2707 Autosampler，Water 2489 UV/Visible Detector）；柱型C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Breeze電腦程序系統。

1.4 提取分離試驗方法

將禿瘡花全草藥材干燥粉碎，取其干粉400 g，用2 000 mL體積分數95%乙醇，在常壓下按照1∶5（g/mL）的固液比超聲波提取3次，45 ℃，每次1 h，過濾，合并濾液，50 ℃減壓回收溶劑，制得乙醇提取物用水充分混懸后，依次用極性由小到大的不同溶劑萃取。用等量石油醚溶劑連續萃取3次，混合萃取液，并減壓蒸餾除去石油醚溶劑，得石油醚萃取相浸膏，剩余水相，加入鹽酸進行酸化（pH 1～2），用等量氯仿溶劑萃取3次，合并萃取液，減壓除去氯仿溶劑，得酸化氯仿相。取1.00 g禿瘡花酸化氯仿相，用48～74 μm硅膠柱層析和中性Al2O3柱層析（規格：35 mm× 280 mm），洗脫劑依次為V（CHCl3）∶V（CH3OH）= 15∶1～8∶1，分離得到196.9 mg紫堇丁堿和488.6 mg異紫堇丁堿[8]。紫堇丁堿占酸化氯仿相的19.7%，異紫堇丁堿占酸化氯仿相的48.9%，兩者合計共占酸化氯仿相的68.6%，是酸化氯仿相的主要有效成分。

2 含量測定

2.1 供試樣品及濃度配制

實時提取物[9]：稱取5 g禿瘡花全草粉末，用95%工業乙醇，于50 ℃超聲提取，提取3次，每次1 h，制得0.855 g醇提物，命名為TCH-1。

禿瘡花中生物堿類化合物紫堇丁堿（Cor）、異紫堇丁堿（Iso-Cor）均為研究分離、提取和純化的單體化合物。

稱取相應量的醇提物和單體化合物，用色譜甲醇溶解，并用0.22 μm超濾膜過濾，配制成相應濃度的甲醇溶液。生物堿單體化合物濃度和醇提物濃度配制梯度見表1和表2所示。

表1 禿瘡花生物堿類單體化合物濃度梯度配制表

表2 禿瘡花醇提物濃度梯度配制表

2.2 定量分析方法[10-11]

采用HPLC（1525-2707 TCM-2489色譜系統）、柱型C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水洗脫體系，洗脫方法為：0～5 min用10%甲醇-水體系溶液平衡柱子，5～35 min由10%甲醇水溶液過渡到100%甲醇體系，進行10%甲醇-100%甲醇體系梯度洗脫，45～48 min由100%甲醇過渡為10%甲醇-水體系，48～50 min用10%甲醇-水體系平衡柱子。上樣量1 mL，進樣體積10 μL，每個樣品運行檢測時間為50 min，柱溫30 ℃，檢測波長260 nm。

2.3 醇提物和單體化合物的保留時間與峰值

圖1為10 g/mL禿瘡花乙醇提取液HPLC分析色譜圖，橫軸是保留時間（單位是min），縱軸是電信號（單位是Au）。在保留時間22 min時有高強度色譜峰。圖2為同一條件下紫堇丁堿和異紫堇丁堿的色譜圖，其保留時間與禿瘡花醇提物一致。

2.4 含量分析

單體化合物的含量計算方法：設單體化合物的濃度梯度，經HPLC分析，建立積分面積與濃度之間關系的回歸方程、線性關系和保留時間（見圖5和表3）；將醇提物中該物質在某一濃度（如10 mg/mL）下的峰面積（y）代入回歸方程，計算出該物質的質量濃度x（mg/mL）；將x帶入物質的含量計算公式，可得該單體化合物在原材料中的含量（注：根據前期試驗，提取率按照平均為17%進行計算）。禿瘡花中紫堇丁堿含量為0.79%、異紫堇丁堿含量為1.33%。

圖1 禿瘡花醇提物（10 mg/mL）的保留時間以及吸光度峰值

圖2 紫堇丁堿和異紫堇丁堿的保留時間以及吸光度峰值

圖3 紫堇丁堿和異紫堇丁堿的積分面積與濃度線性回歸方程和關系圖

表3 2種生物堿單體化合物的線性回歸方程和保留時間

3 討論

利用峰面積與單體化合物濃度之間線性回歸方程和物質的含量計算公式，計算出單體化合物在各自原材料中的含量。異紫堇丁堿占酸化氯仿相的48.9%，紫堇丁堿占酸化氯仿相的19.7%，兩者合計共占酸化氯仿相的68.6%；建立積分面積與濃度之間關系的回歸方程，紫堇丁堿y=16 369 907.7x-393 024.811（R2=0.999 872 719），禿瘡花中紫堇丁堿含量為0.79%；異紫堇丁堿y=13 281 438.44x-36 671.693 15（R2=0.999 834 091），禿瘡花中異紫堇丁堿含量為1.33%。

4 結論

建立禿瘡花中紫堇丁堿和異紫堇丁堿的同步提取分離制備方法，采用HPLC研究藥用植物禿瘡花中分離得到的同分異構體在植物中的含量，并與粗提物保留時間對比定位，檢驗試驗工藝的可行性，初步建立HPLC同時測定生物堿的檢測方法。為進一步研究禿瘡花的藥理活性和構效關系提供試驗數據，為藥食同源植物中單體化合物含量的定量測定奠定試驗基礎和理論依據。