氣相色譜質譜法檢測雞蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺

喬青青，郝莉花，鞏凡，劉燕，趙芳

1. 河南省產品質量監督檢驗院（鄭州 450047）；2. 河南省食品安全數據智能重點實驗室（鄭州 450047）

氟苯尼考又名氟甲砜霉素，是新一代氯霉素類動物專用廣譜抗生素，其抗菌廣譜、吸收好、體內分布廣、安全高效，近年來已在美洲、亞洲和歐洲的20多個國家生產銷售，被廣泛用于畜牧和水產養殖中[1-3]。隨著氟苯尼考在養殖中大量、不規范應用，它在畜禽、水產品等動物性食品中的殘留問題也日益被重視[4-6]。氟苯尼考在動物體內會迅速代謝，主要代謝物為氟苯尼考胺。中國、美國及歐盟均規定了動物組織中氟苯尼考的最大殘留限量[1]，農業部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定了氟苯尼考在動物食品中的最大殘留量，標志殘留物為氟苯尼考胺[9]。最新公布的GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中修訂了氟苯尼考在動物體內的標志殘留物為氟苯尼考及氟苯尼考胺，同時規定家禽產蛋期禁用[10]。因此，建立雞蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺的同時測定的方法具有重要的意義。

目前，國內外對氟苯尼考及氟苯尼考胺的殘留檢測方法雖有報道[11-16]，但氟苯尼考和氟苯尼考胺極性差異大，若直接使用液相色譜質譜法測定較難維護色譜條件，衍生后使用氣相色譜單級質譜法測定容易被假陽性干擾。研究建立的采用氣相色譜飛行時間質譜法同時檢測雞蛋中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留。該方法針對雞蛋的基質，通過衍生消除了極性差異，采用的飛行時間質譜法提高分辨率可以降低假陽性的干擾，因此，該方法適合同時檢測雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的殘留。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

氟苯尼考、氟苯尼考胺標準品（Dr. Ehrenstorfer）；雞蛋，市售；乙腈（TEDIA，色譜級）；

HLB固相萃取柱（60 mg，Oasis，PRiME HLB）；C18固相萃取柱（100 mg，Agilent Bond Elut C18）；氨水、乙酸乙酯、正己烷（分析純）；衍生化試劑：N, O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：三甲基氯硅烷（TMCS）（99∶1）（macklin）；試驗用水為一級水。

氣相色譜串聯質譜儀（Agilent，7200，配有CI離子源）；旋渦混合器（Vortex Mixer，QL-866）；高速冷凍離心機（Dynamica，Velocity 14R）；氮吹儀（廈門科睿特，TTL-DC）；電子天平（上海箐海儀器有限公司，FA2004N）。

1.2 樣品前處理

雞蛋樣品經去殼，均勻制備后，準確稱?。?± 0.2）g試樣，精確到0.000 1 g，于50 mL具塞塑料離心管中，加25 mL 98∶2乙酸乙酯-氨水溶液，渦動1 min，以12 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL離心管中。殘渣加入25 mL乙酸乙酯-氨水溶液，重復提取2次，合并有機相，50 ℃水浴氮吹吹干。

凈化：準確加入3 mL水溶解混勻并準確量取1 mL于活化后的C18固相萃取小柱，加入4 mL水并控制流速2～3 mL/min，抽干后再加入6 mL甲醇并控制流速2～3 mL/min，抽干并收集甲醇相，50 ℃氮氣吹干。

1.3 衍生化

在氮氣吹干的提取物中加入200 μL乙腈復溶，再加入衍生化試劑100 μL，蓋塞并渦旋混合20 s，在60 ℃水浴反應30 min。取出冷卻至室溫，在50 ℃的水浴中氮氣吹干，準確加入1.0 mL正己烷，渦旋混勻，供氣相色譜飛行時間質譜測定。

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱Agilent HP-5MS UI（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱；載氣，He（99.999%）；恒流模式，柱流量1.2 mL/min；不分流進樣，進樣量1 μL；進樣口溫度250 ℃；柱初始溫度60 ℃，保持1 min，程序升溫以20 ℃/min至160 ℃，然后10 ℃/min至260 ℃保持3 min；傳輸線溫度280 ℃。質譜條件：負化學源（NCI）；離子源溫度，150 ℃；接口溫度，250 ℃；反應氣，甲烷（純度≥99.99%）；溶劑延遲時間，13 min；采集模式，SCAN，掃描m/z= 180～450；采集速率5.00質譜圖/s。

1.5 測定方法

取樣品和標準溶液各1 μL，通過自動進樣器注入氣相色譜儀中進行分析，以保留時間、定性離子豐度比定性，定量離子豐度外標法計算樣品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量。目標化合物特征離子質荷比見表1，質譜圖見圖1。

圖1 氟苯尼考和氟苯尼考胺硅烷化衍生物質譜圖

表1 氟苯尼考和氟苯尼考胺硅烷化衍生物特征離子質荷比

1.6 標準曲線繪制

母液配制：用感量0.000 1 g的電子天平準確稱取10.0 mg標準品，溶于10.00 mL甲醇中，配成質量濃度為1.0 mg/mL的標準母液。

基質標準曲線的制作：將母液加入至提取、凈化后的陰性樣品殘渣中，配制成2，5，10，50和100 ng/mL的標準工作溶液，取1.00 mL工作溶液，氮氣吹干后衍生化，以進樣濃度為橫坐標、定量離子豐度為縱坐標，作基質標準曲線。

2 結果與分析

2.1 固相萃取柱洗脫溶劑的優化

將混合標準工作液加入空白基質中，然后加入已活化的C18固相萃取柱，氟苯尼考與氟苯尼考胺加標量100 μg/kg，分別使用2，3，4，5和6 mL水淋洗小柱，后用6 mL甲醇淋洗，洗脫后溶液經處理，儀器測定，以化合物加標回收率指標做單因素試驗，考察結果如圖2所示。

由圖2可以看出，洗脫劑水的用量會顯著影響氟苯尼考胺的回收率，洗脫量為4 mL時，回收率為70%，已經不滿足檢驗回收率要求；洗脫量為3 mL時，可以保證氟苯尼考、氟苯尼考胺的回收率在90%～110%，同時也能夠盡可能將極性雜質洗脫出來。

圖2 洗脫劑水的用量對回收率的影響

將混合標準工作液加入空白基質中，然后加入已活化的C18固相萃取柱，氟苯尼考與氟苯尼考胺加標量100 μg/kg，使用3 mL水淋洗小柱，抽干后分別使用4，5，6，7和8 mL甲醇淋洗，洗脫后溶液經處理，儀器測定，以化合物加標回收率指標做單因素試驗，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，當洗脫劑甲醇用量超過5 mL時，氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率在90%～110%，滿足檢驗回收率要求，這說明這2種化合物已經洗脫出小柱，洗脫量的增加會導致弱極性雜質同時洗脫出來，影響檢驗效果，因此甲醇用量應盡可能減少，然而氟苯尼考胺在甲醇用量超過6 mL時才能充分洗脫，因此甲醇用量在6 mL較合適，在此條件下，2種化合物回收率均在90%～110%，滿足檢驗回收率要求。

圖3 洗脫劑甲醇的用量對回收率的影響

2.2 溶劑提取次數對回收率的影響

將混合標準工作液加入均質好的樣品中，氟苯尼考與氟苯尼考胺加標量100 μg/kg，渦旋混勻，然后加入25 mL氨化乙酸乙酯，渦旋混勻后放入離心機，以12 000 r/min，離心5 min，用吸管將上清液轉移并凈化后上機測試，重復提取過程，以化合物累計回收率為指標，提取次數對提取量的影響見圖4。

由圖4可以看出，隨著提取次數增加，3種化合物累計回收率均升高，當提取次數2次時，回收率已經超過80%，回收率和檢出限均可以滿足檢驗要求。因此將提取次數設定為2次可以滿足檢驗要求。

圖4 提取次數對回收率的影響

試驗將溶劑用量減少至15 mL或20 mL，離心后上清液較難吸取，不易操作，因此單次萃取量25 mL較適宜。

2.3 線性范圍、檢出限、精密度、回收率

用甲醇將標準母液配制成2，5，10，50和100 ng/mL的標準工作溶液，做線性回歸，氟苯尼考R2= 0.999，氟苯尼考胺R2=0.998。通過陰性樣品中添加標準品的方法進行檢出限試驗。結果顯示，氟苯尼考和氟苯尼考胺添加水平為0.5 μg/kg，當質量提取精確度為0.002%時，信噪比S/N為5.6和3.7，由此可以確定該方法氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢出限為0.5 μg/kg。在已知的陰性樣品中分別添加0.5，1.5和10.0 μg/kg的3個水平2種標準品的混合工作溶液，每個水平重復3次，氟苯尼考及氟苯尼考胺的回收率及相對標準偏差（RSD）（n=3）見表2。

表2 雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺加標回收率及相對標準偏差RSD（n=3）

3 結論

試驗建立了氣相色譜飛行時間質譜同時檢測雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的方法，采用C18固相萃取柱作為前處理凈化柱能夠保證目標化合物具有較高回收率。試驗采用的衍生方案消除了氟苯尼考與氟苯尼考胺較大的極性差異，采用的飛行時間質譜法提高分辨率，可以降低假陽性的干擾，該方法簡單、快速、高效，可用于雞蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺的同時測定。