UPLC-MS/MS法測定葡萄干中6種人工合成甜味劑

王遠 ，邢麗杰，李先義，羅瑞峰，劉玉晗

1. 新疆農墾科學院（石河子 832000）；2. 石河子大學食品學院（石河子 832000）

葡萄干是一種具有豐富營養價值的干果，受到全世界的歡迎。葡萄干包含豐富的維生素和礦物質[1]。新疆是我國葡萄干的主要產區，葡萄干產量占世界總量的8.33%，居世界第四位，主要產于吐魯番、哈密和南疆地區[2]。

人工合成甜味劑是一種能改善食品口味的外源添加劑，被廣泛應用于食品加工行業。但是過量地使用或濫用甜味劑會危害人體健康，為此國家對甜味劑的使用范圍及用量進行了嚴格規定[3]。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[4]中對安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜等（圖1）適用范圍及添加限量均有明確規定。而在水果干類中，除了阿斯巴甜允許添加并作了相關規定外，其他均不得添加。

目前人工合成甜味劑的檢測分析主要集中在白酒、飲料、乳制品等方面，檢測方法主要有離子色譜法[5]、氣相色譜法[4]、毛細管電泳法[6]、高效液相色譜法[7-9]、離子色譜-串聯質譜法[10]、液相色譜-串聯質譜法[11-14]等。其中離子交換色譜法前處理過程較為復雜，氣相色譜法檢測甜味劑需要衍生化，步驟繁瑣。由于不同合成甜味劑的最大吸收波長不一致，液相法很難滿足多種甜味劑同時檢測的要求。液相色譜串聯質譜法是近年來食品檢測中常用的分析手段，具有選擇性強、靈敏度高和抗基質干擾能力強等特點，已被廣泛應用于甜味劑的檢測。然而水果干中甜味劑的檢測分析報道較少，同時國家標準中并沒有關于水果干類樣品的分析。因此此次試驗通過對儀器參數和前處理條件的優化，建立一種超高效液相色譜-串聯質譜測定葡萄干中人工合成甜味劑的方法。

圖1 6種人工合成甜味劑結構式

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸（HPLC級，德國CNW公司）；亞鐵氰化鉀和乙酸鋅（分析純，上海安譜實驗科技有限公司）；超純水（18.2 MΩ·cm）。安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜標準品（美國Dr公司）。葡萄干來自新疆不同地區超市和農貿市場，采集的葡萄干樣品先經冷凍，然后進行粉碎，制備好的樣品保存在-20 ℃冰箱中。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜串聯質譜儀TQ-S（美國Waters公司）；MS3 basic漩渦混合器（德國IKA公司）；高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；KQ-600DE超聲儀（江蘇昆山市超聲儀器公司）；超純水儀（成都超純科技有限公司）。

1.3 儀器參數

1.3.1 色譜條件

BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫30 ℃，進樣體積5 μL，流動相為0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），流速0.4 mL/min，梯度洗脫：0～3 min，95%～80%（A）；3～5 min，80%～10%（A）；5～6 min，10%～95%（A）。

1.3.2

電質噴譜霧條離件子源，負離子電離（ESI-），脫溶劑氣800 L/h，干燥氣溫度400 ℃，錐孔氣50 L/h，離子源溫度150 ℃。在分析過程中，以離子對（1母離子和2個子離子）信息比較進行定性分析；以母離子和響應值最高的子離子進行定量分析。6種人工合成甜味劑在多反應監測模式下質譜參數見表1。

表1 多反應監測離子對及質譜條件

1.4 樣品處理

準確稱取2.50 g制備好的葡萄干樣品，加入10 mL 0.1%甲酸水，充分渦旋混勻，超聲提取10 min。然后依次加入1 mL亞鐵氰化鉀和乙酸鋅，渦旋混勻后以10 000 r/min離心5 min。上清液轉移至25 mL容量瓶中。在殘渣中繼續加入10 mL 0.1%甲酸水渦旋混勻，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心5 min，合并上清液，用0.1%甲酸水定容至25 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，上機分析。

1.5 線性范圍及檢出限

6種人工合成甜味劑混合標準溶液的配制：分別準確量取適量6種甜味劑標準儲備液，用0.1%甲酸水逐步稀釋成1，2，5，10，20，50，100和200 ng/mL的系列標準混合工作液。在優化的色譜和質譜條件下分析，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性擬合，分別得到6種甜味劑的線性方程和相關系數。分別計算3倍和10倍信噪時對應的濃度，作為方法的檢出限和定量限。

1.6 回收率及精密度

為了考察方法的準確度和精密度，選取陰性葡萄干樣品進行加標回收試驗，分別添加低、中、高三個水平的6種甜味劑混合標準溶液，每個添加水平連續重復測定6次。按照1.4小節進行樣品前處理，在1.3.1小節的色譜條件和1.3.2小節的質譜條件下測定，計算加標樣品的回收率，同時計算其相對標準偏差。

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜分析

2.1.1 質譜參數的優化

分別配制質量濃度為1 μg/mL的6種甜味劑單個標準溶液，由于甜味劑大多帶有羧基或羥基官能團，在電噴霧離子源內易形成負離子，且響應強度較好。因此，通過對離子源參數、母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數的優化，得到6種甜味劑的最佳質譜參數，見表1。

2.1.2 分離條件的選擇

試驗比較了不同有機相體系（甲醇和乙腈）與水相（添加甲酸）組成對6種甜味劑信號強度和分離效果的影響。結果發現，在同樣的流速下，甲醇-水體系比乙腈-水體系產生的色譜柱壓力高，且超過了色譜柱最高耐壓值，因此選擇乙腈-水體系作為流動相。同時比較了乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水體系對6種甜味劑信號強度和分離效果的影響。結果發現，6種甜味劑在乙腈-水體系（圖2a）中較乙腈-甲酸水體系（圖2b）中峰形對稱性差、分離度低。在乙腈-甲酸水體系中，6種甜味劑在乙腈-0.05%甲酸水體系中響應高于乙腈-0.1%甲酸水體系（圖3），故選取乙腈-0.05%甲酸水體系作為分離6種甜味劑的流動相。

圖2 不同流動體系下6種甜味劑的總離子流圖

圖3 不同流動體系下6種甜味劑的響應

2.2 提取條件的選擇

由于葡萄干樣品本身糖分含量較高，直接提取后，溶液很難通過濾膜，因此在提取過程中加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅進行沉淀。結果發現提取溶液的通過性較好。根據甜味劑的結構并結合標準SN/T 3538—2013《出口食品中6種合成甜味劑的檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》[15]中甜味劑的提取方法，比較了純水、乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水（體積比1∶1）、甲醇-0.1%甲酸水（體積比1∶1）6種體系的提取溶劑對6種甜味劑的提取效率。結果表明，純水、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水3種體系對6種甜味劑的提取效率相對較低，有些組分回收率不足60%。而甲醇-0.1%甲酸水體系對6種甜味劑的提取效率較高，但是甜蜜素、阿斯巴甜和紐甜的回收率均超過130%，這可能是由于甲醇-0.1%甲酸水體系提取了葡萄干基質中更多的其他組分，這些組分對甜味劑產生了基質增強效應。0.1%甲酸水和甲醇-水這2種體系對6種甜味劑的提取效率均較好，但是當0.1%甲酸水作為提取溶劑時，6種甜味劑的峰對稱性好（圖5a）；而當甲醇-水作為提取溶劑時，安賽蜜和糖精鈉的峰均出現前伸，對稱性差（圖5b）。綜上分析，采用0.1%甲酸水作為提取溶劑，能有效地提取葡萄干中6種甜味劑。

圖4 不同提取溶劑下6種甜味劑的提取效率

圖5 不同提取溶劑下6種甜味劑的總離子流圖

2.3 線性相關性

采用外標法定量，在上述儀器條件下進行測定，以MS/MS定量離子色譜峰面積（y）對濃度（x）繪制標準曲線，并求出相應的線性回歸方程及相關系數，6種甜味劑在相應的濃度范圍內均具有良好的線性關系，且相關系數r均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比計算，分別得到6種甜味劑的檢出限和定量限，結果見表2。安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的檢出限均為1 μg/kg，糖精鈉檢出限為2 μg/kg；安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的定量限均為2.5 μg/kg，糖精鈉定量限為5 μg/kg。

2.4 方法的準確度和精密度

按照1.6小節進行回收率和精密度試驗，計算加標回收率和相對標準偏差。從表3可以看出，陰性葡萄干樣品在3個添加水平下6種甜味劑的回收率在81.5%～ 106.7%之間，相對標準偏差在1.7%～6.9%之間。結果表明，該方法測定分析的結果準確、可靠。同時該方法將保留時間和化合物碎片信息結合，進一步對化合物進行定性，大大降低了檢測結果出現假陽性或假陰性的可能。

表2 6種甜味劑的保留時間、線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

表3 6種甜味劑的平均回收率和精密度試驗結果（n=6）

2.5 實際樣品的測定

圖6 6種甜味劑標準品和實際樣品的MRM圖

利用建立的方法對新疆地區不同品種的50個葡萄干樣品進行6種甜味劑檢測，圖6分別是標準品（圖6a）和實際樣品（圖6b）的提取離子質譜圖，結果均未檢出6種甜味劑，這說明在葡萄干的加工和銷售過程中，葡萄干在甜味劑的使用方面相對安全。

3 結論

此次試驗通過對液相條件、質譜條件和提取條件的優化，建立了超高效液相色譜-串聯質譜測定葡萄干中6種人工合成甜味劑的方法，并運用該方法對新疆地區葡萄干樣品進行測定。該方法前處理簡單，靈敏度高，時間短，線性關系、準確度和精密度良好，為葡萄干中人工合成甜味劑的檢測提供檢測依據，同時為水果干類中人工合成甜味劑的檢測提供技術參考。